Na⁺/H⁺交换泵(Na⁺/H⁺ exchanger-1, NHE-1)是维持细胞内pH在中性或偏碱性的一种重要膜蛋白。体外培养的肿瘤细胞在酸刺激下，通过上调NHE-1的表达而加强Na⁺/H⁺交换，从而防止细胞内酸化^［1，2］。由于肿瘤细胞的糖酵解优势，导致其酸性产物的异常增加，因而推测原发性肿瘤在整体条件下，也通过上调NHE-1的表达而阻止细胞内酸化。为证实这一观点，我们的实验采用半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术研究了人肺癌组织细胞NHE-1 mRNA的表达水平。

材料与方法(1)标本：收集我院14例肺癌手术标本及正常肺组织。鳞癌4例；腺癌4例；肺泡细胞癌1例；小细胞性肺癌5例。(2)异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。(3)PCR引物：上游引物:5′AGGATCCCAGCTCCTCAGTCACTT-3′；下游引物:5′-CAGAAGGATCCAGAGG-GAGATCTC-3′,扩增片段长约729bp。(4)作RT-PCR产量与总RNA起始用量的关系曲线。取样本总RNA倍比稀释成4μg、2 μg、1 μg、0.5 μg和0.25 μg，以下游引物进行逆转录后作PCR扩增。反应条件为：94℃变性30秒，53℃退火40秒，72℃延伸2分。30次循环。取15μl pCR反应产物电泳并照相，图像分析仪测得扩增片段的积分吸光度值即产量，制出关系曲线。(5)作RT-PCR产量与循环次数的关系曲线。取总RNA6 μg分成4份逆转录后，分别以25、30、35、40次循环进行PCR扩增。取15μl PCR产物电泳并照相，测扩增片段的积分吸光度值，制出关系曲线。(6)根据以上确定的RT-PCR条件对人肺癌组织及正常肺组织作mRNA表达的半定量研究。每例样本取总RNA1.5 μg逆转录后，作30次循环，相同条件的PCR扩增。取15 μl产物电泳并照相。测扩增片段的积分吸光度值。(7)统计学分析采用t检验，部分资料进行直线回归分析。

结果(1)在30次循环下，总RNA用量在0.25～2.0μg范围内，扩增产量与总RNA用量呈显著的正直线关系(r=0.9997, p＜0.001)；在0.25～4.0 μg范围内，正直线关系为r=0.8858,P＜0.05。(2)在1.5μg总RNA用量下，25～35次循环范围内，扩增产量与循环次数成显著的正直线关系(r=0.9979，P＜0.05)。但40次循环时，已基本达到PCR的平台期，非线性关系(r=0.4101,P＞0.05)。(3)在30次循环,总RNA用量1.5μg的相同条件下，肺癌组织细胞的RT-PCR产量是正常肺组织的11.81倍，二者之间有非常显著的差异(P＜0.001)，表明了人肺癌细胞NHE-1 mRNA的超表达。

讨论在人肝癌细胞株Hep G2中，已检测到NHE-1 mRNA的转录拷贝数比正常肝细胞显著增高^［2］。而本实验直接采用了人肺癌组织手术新鲜标本，因而所检测到其NHE-1 mRNA超表达能反映癌细胞在体内的表达水平。提示人肺癌细胞通过上调NHE-1的表达，增加胞膜上NHE-1的数量分布，从而加强Na⁺/H⁺交换，将大部分H⁺排出胞外，这可能是其在体内条件下细胞内pH调节的主要分子机制和特点。这样不仅能防止细胞内酸化，也导致了细胞外pH的降低和酸性微环境的形成^［1］。这在生物学效应上可能对肺癌的侵袭和抗凋亡生长特性是极为有利的:(1)癌细胞的NHE-1向胞外异常大量地排出H⁺,使交界的正常细胞长期处于不利生存条件之下。同时癌细胞强大的Na⁺/H⁺交换耗费了过多的能量，进一步加速其对糖分的夺取和无氧糖酵解的运作，使正常细胞越来越难以竞争生长。细胞外酸性pH还可激活某些蛋白溶解酶，破坏正常组织的外基质，为癌细胞穿越组织解剖屏障进行侵袭和转移生长创造了有利的条件。(2)近年来还发现细胞内酸化与癌细胞的凋亡密切相关^［3］。因此，如果肺癌细胞不能及时消除胞内异常增多的H⁺，将可能因胞内酸化而诱发凋亡，所以即便肺癌细胞的NHE-1超表达不是引起抗凋亡的直接原因，也对维持其抗凋亡生长特性起重要作用。据此，我们认为，人肺癌细胞NHE-1 mRNA的超表达现象是其pHi调节的主要分子机制，并对维持其恶性生长具有重要生物学意义。

参考文献

1Boyer MJ, Barnard DW, Tannock IF, et al. Regulation of intracellular pH in subpopulation of cells derived from spheroids and solid tumors. Br J Cancer，1993,68:890-700.

2Strazzabosw M, Poci C, Zsembery A, et al. Intracellular pH regulation in hep G2 cells: effects of epidermal growth factor, transforming growth factor-α and insulinlike growth factor-Ⅱ in Na⁺/H⁺ exchange activity. hepatology，1995, 22:588-597.

3黄桂君，钱桂生．pH对细胞凋亡的调控及pH调节的肿瘤治疗研究．科学，1997，228:51-52.

(收稿：1997-12-30修回：1998-07-10)