我们已证实大多数结核分支杆菌耐链霉素(SM)是由于其核糖体S12蛋白编码基因(rpsL)错义突变所致^［1］，在此基础上，通过聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-直接测序法(DS)进一步研究其16S rRNA编码基因(rrs)的突变情况，以探讨其应用价值。

材料与方法从13种分支杆菌、7种非分支杆菌标准株及59株结核分支杆菌临床分离株中提取DNA，以引物INS1和INS2扩增结核分支杆菌复合群插入序列IS986产生245 bp片段^［2］；以引物rrsl(5′-GCCTTCGGGTTGTAAAC)、rrs2(5′-AGTTAAGCCGTGAGATTTCA)和rrs3(5′-GTGTGGGTTTCCTTCCTTGG)、rrs4(5′-CGACACGAGCTGACGACAG)分别扩增结核分支杆菌rrs基因序列的415～614位和820～1067位，产生200 bp(rrs_上)和248 bp(rrs_下)片段。rrs扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳进行SSCP分析。分别以rrs2和rrs3为测序引物对SSCP泳动异常的rrs_上和rrs_下片段进行DS分析。

结果(1)结核分支杆菌rrs基因PCR引物的特异性：引物rrs1、2可扩增结核、卡介苗、鸟、胞内、瘰疬、耻垢、偶然、母牛和浅黄分支杆菌DNA产生200 bp片段，不扩增迪氏、草、海和牛分支杆菌及表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、假白喉杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肺炎球菌；引物rrs3、4可扩增上述所有分支杆菌，而上述非分支杆菌均扩增阴性。(2)结核分支杆菌临床分离株的分析结果：用引物INS1和INS2扩增59株结核分支杆菌分离株，均产生245 bp片段，进一步证明这些分离株均为结核分支杆菌。28株药物敏感株的rpsL、rrs_上和rrs_下基因片段SSCP分析均未见泳动异常。31株耐SM分离株的rpsL和rrs基因分析发现：74%单有rpsL43位密码子突变［AAG(Lys)→AGG(Arg)］，3%有rrs突变，7%有rpsL［43位密码子(1株)：AAG(Lys)→AGG(Arg)，33位密码子(1株)：GTA(Val)→ATA(Lle)］和rrs双重突变，rrs突变均为513位A→C颠换，16%rpsL和rrs未见突变。

讨论rrs基因约1 536 bp，是个非常保守的基因，在分支杆菌之间有很高的同源性^［3］。本文的特异性试验结果表明所设计的引物是分支杆菌属特异的。国外几篇文献^［4～9］报道的107株耐SM分离株中，49%为rpsL突变，29%为rrs基因突变，rrs突变大多位于491、512、513、516、904或905位，以905位的A→G转换和513位A→C颠换为最常见，0.9%rpsL和rrs双重突变，23%未见基因突变。由此可见，本文rpsL突变占绝对优势，rrs突变较少见，双重突变的发生率高于国外，可能系患者抗结核治疗方案中SM应用时间较长，使分支杆菌一个基因突变不足以耐受SM而发生第二次基因突变。尤其是1株rpsL33位密码子突变是否能引起SM耐药尚不可知。rrs的513位突变在大肠杆菌通过基因工程技术已被证明可导致SM高水平耐药性产生。少数结核分支杆菌耐SM分离株有正常的16S rRNA和S12蛋白，却仍显示对SM耐药，这提示存在其它耐药机制，需进一步研究。

总之，大多数结核分支杆菌耐SM是由于rpsL基因突变所致，少数是由于rrs基因突变所致。PCR-SSCP和PCR-DS是快速检测基因突变的有效方法，应用其检测结核分支杆菌临床分离株中rpsL和rrs基因突变只需2～4天时间，可快速检测大多数结核分支杆菌SM耐药性，指导临床治疗。

参考文献

1吴雪琼，庄玉辉，何秀云，等.结核分支杆菌链霉素耐药基因的检测.中华结核和呼吸杂志，1996，19：342-345.

2吴雪琼，庄玉辉，张晓刚，等.PCR和DNA探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究.中华结核和呼吸杂志，1996，19：37-40.

3Kemosern KE, Ji YE, Estrana ICE, et al. The nucleotide sequence of the promotor,16S rRNA and spacer region of the ribosomal RNA operon of M.tuberculosis and comparison with M.leprae precursor rRNA. J Gen Microbiol, 1992,188：717.

4Morris S, Bai GH, Suffys P, et al. Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. JID, 1995,171：954-960.

5Finken M, Kirschner P, Meier A, et al.Molecular basis of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis: alterations of the ribosomal S12 gene and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot. Mol microbiol, 1993,9：1239-1246.

6Meier A, Kirschner P, Bange FC, et al. Genetic alterations in streptomycin resistant Mycobacterium tuberculosis: mapping of mutations conferring resistance. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38：228-233.

7Honore N, Cole ST. Streptomycin resistance in mycobacteria. Antimicrob Agents chemother, 1994,38：238-242.

8Nair J, Rouse DA, Bai GH, et al. The rpsL gene and streptomycin resistance in single and multiple drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. Mol microbiol, 1993, 10:521-527.

9Douglass J, Steyn LM. A ribosomal gene mutation in streptomycin-resistant M. tuberculosis isolates. JID, 1993,167：1505-1506.

(收稿：1998-02-25修回：1998-04-07)