急性肺损伤及其急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是严重危害人民健康的疾病，其发病机理极为复杂。现已明确，氧自由基在急性肺损伤的发病机制中起着极为重要的作用。急性肺损伤发展到ARDS的过程虽然非常复杂，但高通透性肺水肿和肺动脉高压是必定要发生的。我们曾报道过少量的氧自由基即可导致明显的肺通透性损伤，肺微血管的渗漏增强，因而发生显著的肺水肿。我们进一步通过肺动脉内皮细胞对氧自由基刺激的反应，即肺动脉内皮细胞形态学的改变和与肺动脉压升高相关的血管紧张素Ⅱ的分泌探索氧自由基对肺血管的损伤和引起肺动脉高压的机理。

材料与方法细胞株为正常的幼母牛肺动脉内皮细胞株(CPAE)，该株具有血管紧张素转化酶的活性，活性度为85%～95%，购自美国ATCC公司。培养液为最低必须培养基(MEM)，用前加无菌胎牛血清(加入后成为FMEM)使其牛血清终浓度为20%，加青霉素和链霉素至终浓度100 U/ml。次黄嘌呤的工作液浓度为1 mmol/L，黄嘌呤氧化酶(XO)原液的酶活性为50 U/3 ml，两者使用前均以孔径为0.22 μm的细菌滤器过滤。

CPAE细胞株以常规方法复苏，95%为活细胞。然后，将细胞转移至10 ml培养瓶内，在37℃，5% CO₂培养箱内培养。经10天培养后CPAE细胞铺满培养瓶底面，然后用含0.2% EDTA的0.25%胰酶溶液消化细胞，离心收集细胞。将活细胞为95%的内皮细胞，以1.9×10⁶ cell/ml接种到24孔的培养板中，加入MEM液，培养至3、7和25天时进行氧自由基刺激试验。

血管紧张素Ⅱ(AT Ⅱ)放射免疫测定应用北京协和医院内分泌实验室AT Ⅱ抗体(滴度1∶20000)。批内变异系数(CV)%为9.6(n=20)，批间CV%为14.2(n=50)。氧自由基刺激CPAE细胞分泌血管紧张素Ⅱ实验为：(1)将24孔培养的CPAE细胞分成3组，每组8孔，其中每组有2孔做对照，其余6孔作为氧自由基刺激孔。移去培养液，然后每孔加入1 ml FMEM培养液，在培养箱内温育，每15、30、60分钟取出各组培养液留作刺激前的对照；(2)每孔加入0.8 ml FMEM，对照组加入0.2 ml无钙镁盐水，试验组每孔分别加入0.1 ml次黄嘌呤溶液(终浓度为0.1 mmol/L)和0.1 ml黄嘌呤氧化酶溶液(终浓度为0.05 U/ml)放在培养箱内温育，分别于15、30和60分钟取培养液测其血管紧张素Ⅱ的含量。

结果1.次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶对CPAE生长的影响：刺激前各组细胞数差异无显著性(P＞0.05)，但低浓度的黄嘌呤氧化酶作用于次黄嘌呤产生的氧自由基即可影响CPAE的增殖，其特点是：(1)在第1天内最为明显，不但增殖速度明显低于对照组，而且活细胞的比率也显著减低(P＜0.05或0.01)；(2)脱离与氧自由基接触2天(细胞培养第3天)后，细胞增殖逐渐恢复，速度加快，至第5天，活细胞所占比率与对照组已无差别，但培养第7天，所增殖的CPAE细胞数仍远不及对照组；(3)在同样的条件下，氧自由基对CPAE增殖与接触黄嘌呤氧化酶的时间成正比，接触60分钟与接触15分钟和30分钟比较，死亡细胞比率的增高和细胞增殖的抑制均更为明显，恢复也更慢。

2.氧自由基对CPAE细胞分泌AT Ⅱ水平的影响：经氧自由基作用以后，肺血管内皮细胞分泌AT Ⅱ的水平显著提高，不同刺激时间和脱离接触后的不同培养时间所测得的AT Ⅱ水平与对照组比较，差异均有显著性(P＜0.01)。其中，脱离接触后继续培养第7天，CPAE分泌AT Ⅱ的水平最高，对刺激的反应最强，刺激15、30分钟的AT Ⅱ水平分别为912±95 ng/L和1 074±120 ng/L，而对照组仅为234±15 ng/L。但刺激60分钟组的AT Ⅱ水平(865±162 ng/L)反而不及刺激15分钟组和30分钟组。而且培养第25天时细胞分泌AT Ⅱ的水平下降，对刺激的反应减弱。不同刺激时间的AT Ⅱ分泌水平虽有差别，但无统计学意义(P＞0.05)。

3.CPAE细胞对氧自由基刺激所引起的细胞形态学改变：刺激15分钟组未见细胞形态学改变；30分钟组即可见细胞变长，细胞核移向边缘；刺激60分钟时可见细胞变长更明显，并按长径方向平行排列，细胞核移向椭圆形细胞的长径顶端，贴近细胞壁。受氧自由基刺激的CPAE细胞继续培养2周，其形态恢复情况为：刺激30分钟的细胞，形态恢复正常。然而，刺激60分钟的细胞，其细胞核仍未回到原位，1个月后细胞形态才恢复原状，AT Ⅱ的分泌才恢复到原来的水平。

讨论我们的结果揭示了氧自由基的刺激可以使具有血管紧张素转化酶活性的CPAE细胞发生一系列的变化，主要为：(1)氧自由基明显地抑制CPAE细胞的增殖；(2)氧自由基可导致CPAE细胞的急性凋亡；(3)可引起CPAE细胞的明显形态学改变；(4)可促进AT Ⅱ的分泌。在一定的时间内，上述改变随氧自由基刺激时间的延长而增加。但刺激时间过长，细胞即出现明显损伤。氧自由基所引起的肺血管内皮细胞的一系列改变需要数日甚至数周方能恢复。上述结果提示氧自由基、黄嘌呤氧化酶可能通过刺激AT Ⅱ的分泌而参与急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征时肺动脉高压的形成。因此避免氧自由基产生、清除氧自由基和保护肺血管内皮细胞等均为防治ARDS的重要环节。

本课题受国家科委“九五”哮喘攻关基金资助(基金编号：96-906-02-04)

(收稿：1996-11-26修回：1998-03-06)