关键词： 分支杆菌，结核；聚合酶链反应；结核，淋巴结

【摘要】目的探讨单管巢式聚合酶链反应(SN-PCR)检测石蜡包埋组织结核分支杆菌DNA的特异性和敏感性。方法应用普通PCR(G-PCR)、双管巢式PCR(DN-PCR)和SN-PCR对结核分支杆菌BCG和30例结核性淋巴结炎石蜡包埋组织进行结核分支杆菌复合群IS6110特异插入序列片段DNA检测。结果DN-PCR和SN-PCR检测BCG DNA均于15 fg以上呈现阳性结果，其敏感性明显优于G-PCR(480 fg)。G-PCR、DN-PCR和SN-PCR检测30例结核性淋巴结炎阳性率分别为43%、100%和100%，抗酸染色阳性率(10%)与3种PCR法相比差异有非常显著意义(均P＜0.01)。G-PCR阳性率与DN-PCR和SN-PCR相比差异亦具非常显著意义(均P＜0.01)。SN-PCR阳性率与DN-PCR相同。结论巢式PCR检测淋巴结石蜡包埋组织结核分支杆菌的敏感性显著高于G-PCR，其中SN-PCR具有与DN-PCR相同的特异性和敏感性，并具有更大的实用价值。

Single-tube nested polymerase chain reaction technique in detecting Mycobacterium tuberculosis DNAMa

Hongda, Zhu Jun, Zhang Naixin, et al. Department of Pathology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070

【Abstract】ObjectiveTo study the sensitivity and specificity of single-tube nested polymerase chain reaction (SN-PCR) technique in detecting Mycobacterium tuberculosis DNA in paraffin-embedded tissues.MethodBCG DNA and the paraffin-embedded tissues of 30 cases with typical tuberculous lymphadenitis were examined to detect the IS6110 specific insertion sequence DNA of Mycobacterium tuberculosis complex by general PCR(G-PCR), double-tube nested PCR (DN-PCR) and SN-PCR techniques.ResultFifteen fg or more BCG DNA could show positive results by DN-PCR and SN-PCR techniques, while 480 fg by G-PCR method. The positive rates of G-PCR, DN-PCR, and SN-PCR in detecting Mycobacterium tuberculosis DNA in 30 cases with tuberculous lymphadenitis were 43%, 100%, and 100% respectively, all of which were significantly different (P＜0.01) from that of the acid-fast stainning method (10%). Significant differences in the positive rates also existed between G-PCR and DN-PCR, G-PCR and SN-PCR (both P＜0.01), while the positive rates of DN-PCR and SN-PCR were found same.ConclusionThe sensitivities of nested PCR techniques in detecting Mycobacterium tuberculosis are significantly higher than that of G-PCR, whereas the sensitivities as well as the specificities of SN-PCR and DN-PCR are the same. Thus SN-PCR seems more practicable.

【Key words】Mycobacterium tuberculosisPolymerase chain reactionTuberculosis, lymph node

巢式聚合酶链反应(PCR)较普通PCR具有更高的敏感性和特异性^［1，2］。我们采用两对复性温度不同的巢式PCR引物，在同一反应体系中一步完成巢式PCR扩增，即单管巢式PCR(SN-PCR)，并对石蜡包埋组织中结核分支杆菌特异性DNA片段进行检测，探讨SN-PCR检测石蜡包埋组织结核分支杆菌的特异性和敏感性。

材料与方法

1.材料：(1)实验组：选取1993～1996年间收验的30例典型结核性淋巴结炎患者的常规石蜡包埋组织标本，其中增生为主性、干酪样坏死为主性和混合性者各10例。(2)牛型结核分支杆菌BCG(卫生部北京生物制品研究所产品)：作为PCR检测的阳性对照和敏感性指标。(3)1例抗酸染色呈强阳性的肺结核患者常规石蜡包埋组织标本和1例抗酸染色阴性的新生儿正常肝脏常规石蜡包埋组织标本分别作为PCR检测的阳性和阴性对照。

以上所用石蜡包埋组织均先经10%甲醛溶液固定，常规厚5 μm连续切片，用于HE染色、抗酸染色和PCR检测。

2.方法：(1)抗酸染色：实验组和用于PCR检测的阳性、阴性对照石蜡切片均行Ziehl-Neelsen抗酸染色。(2)PCR检测：引物：由结核分支杆菌复合群(人型、牛型、BCG)DNA特异性插入序列IS6110衍生的引物^［3］由美国CyberSyn公司合成，序列为：外引物(扩增产物为580 bp)：5′-GGACAACGCCGAATTGC-GAAGGGC-3′和5′-TAGGCGTCGGTGACAAAGGCCAC-G-3′；内引物(扩增产物为181 bp)：5′-ACGACCACATCAACC-3′和5′-AGTTTGGTCATCAGCC-3′。模板制备：①BCG DNA：BCG溶于TE缓冲液，加溶菌酶1 mg/ml，37℃ 1小时，再加入蛋白酶K 200 μg/ml、0.4%聚丙烯酰胺(SDS)37℃ 3小时，酚氯仿异戊醇抽提。紫外分光光度计分析并定量。②石蜡包埋组织：每例样本取5 μm厚切片5片，经脱蜡、脱苯后，加入消化缓冲液(pH 8.5和100 mmol/L Tris-Hcl、1%SDS和300 μg/ml蛋白酶K)，60℃过夜，离心沉淀，弃上清液，加菌裂解液(pH 8.5的10 mmol/L Tris-Hcl、1 mmol/L EDTA和1% Triton)。PCR扩增反应体系均采用50 μl。③普通PCR(G-PCR)：仅用内引物在PCR扩增仪(PTC-150型，美国MJ公司产品)内进行扩增。内引物各500 nmol/L，dNTP各200 μmol/L，Mg²⁺1.5 mmol/L，模板2 μl，99℃预变性10分钟后加入Taq DNA聚合酶1U，然后进行30次循环：95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟；最后一次循环72℃延伸5分钟。④双管巢式PCR(DN-PCR)：先用外引物进行第一轮扩增；再取适量的第一轮扩增产物置于另一个反应体系中，用内引物进行第二轮扩增。第二轮扩增方法完全与G-PCR相同，第一轮扩增除改用外引物、退火温度为65℃外，其他与G-PCR相同。⑤SN-PCR：将外引物和内引物同置于一个反应体系中，先以外引物进行前20次循环(相当于DN-PCR的第一轮扩增)，然后在同一反应体系中再以内引物进行后30次循环(相当于DN-PCR的第二轮扩增)。但是SN-PCR：(A)外引物剂量为10 nmol/L(仅为DN-PCR外引物剂量的1/50)；(B)每次扩增循环反应的时间缩短一半(30秒)；(C)前20次循环的退火温度为65℃，后30次循环为50℃。扩增产物的电泳分析：取PCR扩增产物5 μl，置于1.3%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。紫外线透射分析仪下呈现580 bp特异条带者为外引物扩增阳性，181 bp特异条带者为内引物扩增阳性。每批实验中均同时分别采用上述阳性或阴性对照检材进行全程实验的阳性或阴性对照。

以上试剂均购自上海Promage公司。统计学分析采用χ²检验。

结果

一、抗酸染色

实验组30例中仅3例(10%)偶见抗酸杆菌，其病变皆以干酪样坏死为主。

二、PCR检测BCG DNA

G-PCR法检测BCG DNA，浓度于480 fg(约160条结核分支杆菌DNA量)以上呈现阳性结果；DN-PCR和SN-PCR检测BCG DNA，均于15 fg(约5条菌)以上呈现阳性结果。结果显示，巢式-PCR的敏感性明显优于G-PCR，其中SN-PCR和DN-PCR的特异性和敏感性相同。

三、PCR检测石蜡包埋组织标本

30例结核性淋巴结炎结核分支杆菌的检测。结果表明：(1)G-PCR、DN-PCR和SN-PCR法检测阳性率分别为43%、100%和100%，抗酸染色的阳性率(10%)与3种PCR法相比差异有非常显著意义(均P＜0.01)；(2)G-PCR的阳性率分别与DN-PCR和SN-PCR法相比差异有非常显著意义(均P＜0.01)；(3)SN-PCR(附图)和DN-PCR法检测的阳性率相同。

附图SN-PCR检测30例结核性淋巴结炎结核分支杆菌特异性序列片段

讨论

本研究中3种PCR法检测都设置了石蜡包埋组织的阳性和阴性对照，并设置结核分支杆菌BCG作为阳性对照，均分别相应地呈现阳性和阴性结果，因此应用PCR检则的结果是可靠的。存档的石蜡包埋组织标本，由于经过固定、包埋和较长时间的储存等处理，结核分支杆菌DNA可发生变性、断裂和降解等改变^［4，5］。因此，应用PCR技术检测石蜡包埋组织结核分支杆菌的敏感性明显低于新鲜组织标本，可造成石蜡包埋组织检测的假阴性结果。我们的结果显示，G-PCR检测BCG DNA于480 fg(约160条菌)以上呈现阳性结果，而巢式PCR(包括DN-PCR和SN-PCR)均于15 fg(约5条菌)以上呈现阳性结果，其敏感性明显优于G-PCR。这与有些作者的研究结果基本一致，他们认为巢式PCR较普通PCR具有更高的敏感性和特异性^［1，6］，其检测的敏感性多为数条结核分支杆菌^［7］。因此应用巢式PCR检测石蜡包埋组织中结核分支杆菌的敏感性可大大提高，从而降低G-PCR检测的假阴性结果。

巢式PCR经过连续两轮PCR扩增，最终扩增产量较只进行一轮扩增的G-PCR法成千倍地提高，显著增强了PCR的敏感性，并使其电泳条带更清晰、整齐，便于判断。此外，G-PCR常需应用分子杂交法对扩增产物的特异性进行验证。而巢式PCR内引物介导的第二轮PCR是以外引物介导的第一轮的PCR扩增产物为模板，相当于对第一轮PCR产物进行了验证，虽仍需分子杂交予以支持，然而两轮PCR扩增强化了巢式PCR的特异性^［8，9］。我们对30例结核性淋巴结炎石蜡包埋组织的检测结果显示