关键词： 离子通道；肺动脉；平滑肌细胞；缺氧症

【摘要】目的研究急性缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道活性的影响，以探讨钾通道活性改变在急性低氧性肺血管收缩(HPV)反应中所起的作用。方法应用膜片钳单通道技术，在对称性高钾溶液中，于急性酶分离的大鼠单个肺动脉平滑肌细胞的内面向外式膜片 (inside-out patch)上，记录外向性钾通道电流，并用常氧和低氧的细胞浴液持续灌流肺动脉平滑肌细胞，以观察其对外向性钾通道电流的影响。结果在记录的外向性钾电流中，证实了一种电流为钙、ATP激活性钾通道(K⁺_Ca-ATP)；用低氧的细胞浴液灌流肺动脉平滑肌细胞可明显抑制这种钙、ATP激活性钾通道的活性(P＜0.01)。而钾通道开放剂卡吗克啉(cromakalim)对低氧所抑制的肺动脉平滑肌细胞钙、ATP激活性钾通道具有明显的激活作用(P＜0.01)。结论急性低氧可通过对钙、ATP激活性钾通道的抑制作用，使肺动脉平滑肌细胞膜发生去极化，肺动脉收缩而导致急性肺血管阻力增加，进而产生肺动脉高压。肺动脉平滑肌细胞钙、ATP激活性钾通道活性的降低，可能在低氧性肺血管收缩反应中起着重要的作用。Cromakalim可作为拮抗低氧性肺血管收缩的有效药物之一。

The inhibition effect of acute hypoxia on K⁺_Ca-ATP channels of pulmonary artery smooth muscle cells of rats

Xiao Xinrong, Chen Wenbin, Cheng Deyun. Respiratory Department, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Science, Chengdu 610041

【Abstract】ObjectiveTo explore the possible mechanism underlying hypoxic pulmonary vasoconstriction, we evaluated the effect of acute hypoxia on potassium channels in pulmonary artery smooth muscle cells.MethodThe single smooth muscle cell was freshly isolated from pulmonary artery (Φ700～200 μm) of Wistar rats with acute enzymatic digestion method. In symmertrical high K⁺ solution, we separated one outward K⁺ current from the patch of smooth muscle cells with inside-out configuration using patch-clamp technique. According to the electrophysiological response to the patch channel, this current was identified as the Ca²⁺, ATP activated potassium channel (K⁺_Ca-ATP). The hypoxic solution was obtained by aeration with 5% CO₂-balance N₂ mixurte.ResultThe currents of K⁺_Ca-ATP in the patch of smooth muscle cells was much inhibited while the oxygen tension of solution was reduced from normoxic (PO₂≥13.33 kPa) to hypoxic (PO₂≤2.67 kPa) levels (P＜0.01). Cromakalim (10 nmol/L), an opener of potassium channel, could activate the currents of K⁺_Ca-ATP decreased by acute hypoxia (P＜0.01).ConclusionAcute hypoxia has an inhibition role on K⁺_Ca-ATP currents in pulmonary artery smooth muscle cells, causes the membrane potentional depolarization, leads to pulmonary vasoconstriction, increases pulmonary vascular resistence and artery pressure. The decrease of K⁺_Ca-ATP contributes to development of hypoxic pulmonary vasoconstriction. Cromakalim is one of effective antagonists for hypoxic pulmonary vasoconstriction.

【Key words】Ion channelsPulmonary artery Muscle smooth cellsAnoxia

1967年Bergofsky等就发现低氧可使肺血管平滑肌去极化，并认为低氧性肺血管收缩(HPV)可能为低氧对血管平滑肌细胞去极化的直接作用。后来Suzuki等研究证实，慢性缺氧7天可使大鼠肺动脉主干平滑肌细胞去极化，使细胞膜静息电位由-52上升至-42mV。由于HPV反应并非完全依赖于血管内皮细胞，因此，肺血管平滑肌细胞的功能改变可能在介导HPV反应中起着更加积极的作用^［1］。细胞膜电位的建立主要由细胞内外钾离子梯度所决定，而细胞膜钾通道活性直接调节着细胞内外钾离子梯度的大小^［2］。因此，缺氧与肺血管平滑肌细胞钾通道活性之间的关系成为近年来研究的重点^［3］。我们应用膜片钳技术，研究急性缺氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞钾通道活性的影响，以探讨钾通道活性的改变在HPV反应中所起的作用。

材料与方法

1.实验动物：雄性Wistar大鼠，体重250～320 g（购于华西医科大学实验动物中心）。

2.实验试剂和药物：胶原酶Ⅺ，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸［4-(2-hydroxyethyl-1-piperazine-ethanesulfonic acid,HEPES)，小牛血清白蛋白，木瓜蛋白酶(papain)，卡吗克林(cromakalim)，四乙胺(TEA)， 4-氨基吡啶(4-AP)，ATP 钠(Na₂-ATP)，乙烯乙二醇-双(β-氨基乙醚) -N,N,N′,N′- 四乙酸(ethyline glycol-bis(β-aminoethyl ether )-N,N,N′,N′-tetraacetic acid, EGTA］和4,4′- 双异硫氰酸芪-2,2′- 双磺酸(4,4′-diisothiocyano-stilbene-2,2′-disulphonic acid，DIDS，均购于SIGMA公司)；二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT，Promega公司) ,HEPES缓冲的细胞分离液(HPSS)。

3.主要实验仪器：膜片钳放大器(CEZ-2200 Nihon Konden，Japan)，微电极拉制仪(PP-83 Narishige，JaPan)，微电极抛光仪(MF-83 Narishige)，倒置相差显微镜 (IMT-2 Olympus，Japan)，三维操纵器(WN203 Narishige，Japan)，电子计算机(586)，数模转换器(Digital-1200 Axon Instrument American)，激光打印机(Laserjet ⅢHP) ；微电极玻璃毛坯(购于上海脑生物所) 。

4.实验步骤：(1)细胞准备：大鼠采用1％戊巴比妥钠腹腔内麻醉(33 mg/kg)后，剖胸，迅速取出心脏和肺脏，置于细胞分离液(HPSS)中，清洗瘀血后，在体视显微镜下，沿右心室连接的肺动脉段和肺动脉主干，分离出左右肺动脉(Φ700～200 μm)分支。将动脉管沿纵行方向剖开，并将血管壁剪成1 mm×1 mm的组织小片。在盛有组织小片的试管中加入低Ca²⁺的HPSS液2 ml(Ca²⁺：20 μmol/L)，内含胶原酶Ⅺ 1 mg/ml，小牛血清白蛋白2 mg/ml，37℃孵育酶解40分钟，1 000 r/min离心5分钟，用无Ca²⁺的HPSS液洗涤2次，再低速离心5分钟，均弃上清液。加入低钙HPSS 液4 ml，用尖端抛光、开口较大的巴斯德(pasteur)吸管轻柔地吹打20分钟，即得到单个的肺动脉平滑肌细胞，将其储存于4℃下，在6小时内备用^［4］。(2)溶液配制：采用高钾对称性溶液。①电极液：KCl 140 mmol/L;MgCl₂ 1.5 mmol/L; HEPES 10 mmol/L; EGTA 5 mmol/L; CaCl₂ 4.55 mmol/L; DIDS 0.1 mmol/L; pH 7.3，②细胞浴液：KCL 140 mmol/L; MgCl₂ 1.0 mmol/L; HEPES 10 mmol/L; glucose，10 mmol/L; CaCl₂ 5.12 mmol/L; EGTA 7.0 mmol/L; DIDS 0.1 mmol/L; pH 7.3。(3)高阻封接及膜片形成：在倒置相差显微镜下，选择分散的、形态典型、表面光滑的肺动脉平滑肌细胞，应用三维显微操纵器的粗推将微电极尖端与待测细胞接近，然后改换细推使微电极尖端与细胞表面接触，同时由计算机经膜片钳放大器向微电极发放一电压为0.1 mV，波宽为40 ms的脉冲方波，然后通过与探头相连的负压抽吸管向微电极尖端施以0.49～1.96 kPa(1 kPa=7.5 mmHg)的负压，使微电极尖端与细胞膜形成近似电绝缘，计算机显示其阻抗值≥1 GΩ(1 G=1×10⁹)，即形成高阻封接(giga-seal) ，这时形成的膜片为细胞贴附式(cell-attached patch)；此时，只要轻轻提起电极，将其尖端暴露于空气中几秒钟，即形成内面向外式膜片(inside-out patch)。(4)细胞急性缺氧和常氧方法：在配制好的细胞浴液中通过发泡形式预先灌充含有5％CO₂的氮气30分钟，使细胞浴液的液氧分压≤2.67 kPa (取样作血气分析测定证实)。缺氧的细胞浴液通过微蠕动泵以2～3 ml/min的速度对待测细胞进行持速灌流^［5］。常氧是以含有5％CO₂的O₂代替含有5％CO₂的N₂，使灌流的细胞浴液的液氧分压≥13.33 kPa。(5)数据采集、输入与分析：①数据采集及输入：数据采集与输入均使用Axon公司(Axon Instructment)软件pClamp 6.02。②数据分析：实验所得数据仍采用软件pClamp 6.02版本进行处理。数据处理后可得开放概率(P_open)、开放时间(T_open)和关闭时间(T_close)。

5.统计学处理：实验结果采用t检验，数据以±s表示。

结果

一、肺动脉平滑肌细胞钙、ATP激活钾通道的电生理测定

1.单通道电流和电导值：在正常氧分压下，该通道电导值为240.0±9.81 pS，具有明显的电压依赖性，属电压门控性钾离子通道。

2.ATP 对单通道活性的影响：ATP在低浓度(≤8 μmol/L)时对该通道的激活作用很小，控制游离钙离子浓度(1×10