应用聚合酶链反应(PCR)结合Southern转移、光敏生物素标记DNA探针杂交(SBH)及巢式PCR技术进行了结核分支杆菌的实验与临床应用比较研究。

材料与方法(1)细菌及标本DNA抽提：人型、牛型结核分支杆菌、卡介苗、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、大肠杆菌DNA制备参照Hermans等^［1］方法。106份结核性痰标本取自杭州市结核病防治院住院肺结核病例，经临床、X线及细菌学检查确诊，抗结核治疗有效。21份非结核性痰标本(肺癌16份，肺炎5份)，经细菌学和治疗效果证实。以NaOH消化、酶裂解后用经典酚/氯仿法抽提DNA。(2)巢式PCR和SBH：巢式PCR试剂盒由军事科学院提供。以内引物试剂盒扩增人结核分支杆菌DNA，经低溶点琼脂糖凝胶电泳回收DNA，并用光敏生物素(军事医学科学院产)标记成为DNA探针。标本先用外引物PCR试剂盒扩增并电泳，阳性者可见一条442 bp扩增带，阴性者取其产物5 μl进行巢式PCR，阳性者可见254 bp扩增带。同时取第一次扩增产物予Southern转移过夜，杂交膜烘干固定后进行预杂交、杂交、洗膜、封闭、加酶显色等。

结果PCR检测人结核分支杆菌DNA低限为5 pg，巢式PCR和PCR+SBH法均为50 fg。两者均对结核分支杆菌高度特异，仅人型、牛型结核分支杆菌和卡介苗阳性。106份结核性痰标本PCR阳性49份(46.2%)，PCR+SBH阳性81份(76.4%)，巢式PCR阳性74份(69.8%)，后二者均明显高于PCR法(χ²=20.365，12.104，P均＜0.01)。而两者之间差异无显著性(χ²=1.176,P＞0.05)。比较PCR+SBH和巢式PCR阳性分布情况，两者有较好的一致性(χ²=22.194，P＜0.01)。巢式PCR阴性而PCR+SBH阳性15份。巢式PCR阳性而PCR+SBH法阴性8份，经模板稀释10倍后再次PCR有4例阳性。21份非结核性痰标本PCR、巢式PCR及PCR+SBH均阴性。

讨论我们应用巢式PCR和PCR+SBH法检测人结核分支杆菌DNA，检测低限达50 fg，为PCR敏感性的100倍，并保持了PCR的高度特异性。对临床标本检测结果表明，两者检测结核性痰标本阳性率(70%、76%)明显高于PCR(46%)，并有较好的一致性。其中PCR+SBH阳性而巢式PCR阴性15份，可能与杂交结果直观可靠、便于判定、而巢式PCR扩增干扰因素多、电泳后扩增带较复杂致判断困难及漏判有关。另8份标本PCR+SBH阴性而巢式PCR阳性，经模板稀释后再次PCR有4份转阳，说明模板中存在某种PCR抑制物质如残留血红蛋白、DNA抽提试剂等。巢式PCR在一定程度上稀释了第一次PCR反应体系中存在的抑制物质，部分消除抑制现象，使靶DNA得到扩增^［2］。

总之，巢式PCR和PCR+SBH法均可显著提高结核性标本阳性检出率，PCR+SBH法结果直观可靠，更优于巢式PCR。但其操作过于繁琐，如能将其简化并制成快速诊断试剂盒^［3］，不失为一种高效、快捷的辅助诊断手段。

参考文献

1Hermans PWM, Schuitema ARJ, Sooligen DV, et al. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1990, 28:1204-1213.

2Folgueira L, Delgado R, Palenque E, et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in clinical samples by using a simple lysis method and polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 1993, 31:1019-1025.

3Jonas V, Alden MJ, Curry JI, et al. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by amplification of rRNA. J Clin Microbiol, 1993, 31:2410-2416.

(收稿：1997-12-02修回：1998-03-19)