关键词： 肺纤维化；肺泡Ⅱ型上皮细胞；表面活性物质蛋白；博莱霉素

【摘要】目的观察博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织表面活性物质蛋白（SP）A、B、C mRNA的表达。方法气管内灌注博莱霉素A₅,复制肺纤维化模型，分别于3、7、14和28天处死动物，提取肺组织总RNA，进行Northern杂交。结果肺纤维化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞数量增加。灌注博莱霉素后第3天SP-A、SP-B及SP-C mRNA的表达即开始下降，7天时降至最低点，而后于14天时开始回升，至28天时上升最明显。但仍低于正常。结论博莱霉素致纤维化大鼠肺组织SP-A、SP-B及SP-C mRNA的表达减低。肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的改变可能参与肺纤维化的发病过程。

Expressions of surfactant protein SP-A,SP-B,and SP-C mRNA in lungs of rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis

Song Mingchen,He Bing,Qiu Zhoumin,et al.The First Hospital of Beijing Medical University Beijing 100034

【Abstract】ObjectiveThe expressions of surfactant protein (SP)SP-A,SP-B,and SP-CmRNA in lungs of rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis were studied.MethodA single dose of bleomycin(BLM) was intratracheal injected to induce pulmonary fibrosis of rats. Animals were killed at day 3,7,14and 28 after BLM administration. The total RNA was extracted from the lung tissue. The expressions of SPsmRNA were analyzed with Northern blot.ResultThe number of alveolar type Ⅱ epithelial cells increased in BLM-administered rats. The expressions of SP-A,SP-B and SP-CmRNA decreased at day 3 after BLM administration and decreased maximally at day 7,and then began to increase at day 14 and significantly increased at day 28,though they were still below the control levels.ConclusionThe results show that the changes of expressions of SP-A,SP-B and SP-CmRNA occur during the development of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats and they may play a role in the pathogenesis of lung fibrosis.

【Key words】Pulmonary fibrosisAlveolar type Ⅱepithelial cellSurfactant proteinBleomycin

肺间质纤维化的发病机制尚未完全清楚。肺泡上皮细胞结构和功能可能的改变参与肺损伤后肺纤维化的发病机理^［1］，但二者之间的关系至今尚未阐明。肺泡Ⅱ型上皮细胞的主要功能之一是合成和分泌肺表面活性物质(SP)，后者具有降低肺泡表面张力，维持肺泡稳定的作用。肺表面活性物质为磷脂和蛋白的混合物，尽管SP含量不足10％，但其对表面活性物质的代谢、功能以及肺的防御功能反应有重要作用。目前已有4种SP被确定，分别称之为SP-A、SP-B及SP-C和SP-D^［2，3］。有关肺纤维化时SPs mRNA表达的变化及其规律国内外尚未见报道。为此我们观察了博莱霉素(BLM)A₅致大鼠肺纤维化模型肺组织SP-A、SP-B及SP-C mRNA表达水平的变化，并与Ⅱ型上皮细胞的数量及肺组织的病理学改变进行了对比研究，以探讨其在肺纤维化时的改变。

材料与方法

1.肺纤维化动物模型的制备：Wistar雄性大鼠80只，体重220～280 g，随机分为纤维化模型3、7、14、28天组和正常对照组共5组，每组16只。实验组经气管内灌注BLM-A₅ 0.5 mg/0.125 ml/100 g(天津河北制药厂生产)，对照组气管内灌注生理盐水0.125 ml/100 g。分别于灌注BLM后3、7、14和28天用腹主动脉放血法分批处死，正常对照组于灌注生理盐水后第3天将动物处死。每组取8只用于病理学检查及Northern杂交，另8只用于分离Ⅱ型上皮细胞。

2.病理学检查：动物处死后，留取右下肺组织用3％戊二醛固定，常规制作电镜标本，在透射电镜下观察。余右肺组织用于提取总RNA。

夹闭右肺主支气管，经气管灌注10％甲醛溶液行内固定，30分钟后将左肺投入10％甲醛溶液中固定24小时。石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察。

3.肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、纯化和培养：大鼠腹腔注射肝素(4 000 U/kg)抗凝，5分钟后腹腔注射0.25%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。行气管插管，腹主动脉放血。用PBS行右心灌流以去除肺血。同时用注射器通过气管插管行人工通气，直至肺脏呈乳白色。用PBS行支气管肺泡灌洗，每次10 ml，共计8～10次。完整取下心肺，再向肺内注入0.25%胰蛋白酶(Difco laboratorics产)15 ml，于37℃水浴中消化20分钟，其间10分钟后补充胰蛋白酶10 ml。然后用5 ml未灭活胎牛血清及0.5 ml 0.25% DNA酶Ⅰ（华美生物公司产品)终止消化。将肺组织充分剪碎，摇床中振荡5～10分钟，用孔径80 μm和38 μm尼龙网逐级过滤，将滤液4℃1 000 r/min，离心10分钟。以3 ml DMEM(含0.25% DNA酶Ⅰ1 ml)重新悬浮细胞，加在10％和30％percoll(Phamacia产品)密度梯度层上，4℃ 1 000 r/min，离心20分钟。回收10％及10％和30%界面细胞，DMEM洗2次。用含10％胎牛血清的DMEM调节细胞密度为10⁶/ml接种于280 ml塑料瓶中，于37℃、5％CO₂培养贴壁1小时，细胞悬液转移至另一培养瓶中，于同样条件下培养24小时。吸去未贴壁的细胞，余为纯度较高的肺泡Ⅱ型上皮细胞。用丹宁酸染色鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞的纯度为90％以上；计肺泡Ⅱ型上皮细胞数。

4.肺组织总RNA的提取和Northern杂交：按异硫氰酸胍一步法^［4］提取肺组织总RNA。取总RNA 30 μg电泳、转膜。SP-A、SP-B及SP-C cDNA探针由美国Fisher教授惠赠。采用随机引物标记法(Primer-α-labering system美国Promega公司）标记探针，进行Northern杂交。用IBAS 2000图像分析仪对X光片上的杂交信号进行灰度扫描，计算SP-A、SP-B及SP-CmRNA的相对含量。

结果

一、肺组织病理学改变

正常对照组双肺未见明显病变。实验组第3、7天双肺有散在的点、灶状出血；第14、28天双肺苍白，硬度增加，体积缩小。实验组注药后第3天，HE染色可见肺内小灶状或大片状炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚，肺泡腔内有游离的中性粒细胞和巨噬细胞。第7天肺泡炎更加明显，肺泡间隔增厚，可见成纤维细胞、毛细血管增生，病灶内、病灶间肺泡萎陷。电镜观察见实验组注药后3天见肺泡Ⅰ型细胞受损，上皮基底膜水肿、裸露，甚至断裂。3～14天可见Ⅱ型细胞增生、肿胀、核增多，其内板层体明显增多。28天时Ⅱ型细胞数目较前减少，间质纤维组织增生明显。

二、肺泡Ⅱ型上皮细胞数量

正常对照组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的平均数量为1.20±0.06×10⁷/只；3天实验组肺泡Ⅱ型上皮细胞数量增加近10倍（10.80±0.17×10⁷/只）；之后下降，但到28天时Ⅱ型细胞数量仍略高于对照组水平。

三、Northern杂交

3天实验组SP-A、SP-B、SP-CmRNA表达较对照组明显减低，7天组为最低；14天组开始回升，28天组表达量接近正常对照。

讨论

本实验发现，实验组动物灌注BLM后3～14天肺泡炎明显，第7天开始出现纤维化，至28天肺纤维化已成为主要病变。这些改变与文献报告一致，表明本组动物模型是成功的。

肺损伤后肺泡结构的重建有赖于肺泡上皮的再生。我们发现整个实验周期内肺泡Ⅱ型上皮细胞都有明显增生，其增生高峰在注药后第3天，以后逐渐下降，与Khali等的报告基本一致^［5］。超微结构可见肺泡Ⅱ型上皮细胞明显增生、肿胀、核增多，板层体丰富。

肺表面活性物质是肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的一种磷脂和蛋白的混合物，主要活性成分是二棕榈酰卵磷脂（DEPC）和SPs。SPs虽仅占肺表面活性物质总量的10％左右，但具有广泛的生理功能。SP-A为亲水性糖蛋白，具有调节肺泡Ⅱ型上皮细胞对表面活性物质的分泌和再摄取；降低肺泡表面张力；以及逆转渗漏入肺泡中的血浆蛋白对表面活性物质的抑制等作用。SP-B、SP-C是疏水性蛋白，主要效应是促进磷脂吸附和分布到肺泡气-液交界面，促进磷脂单分子层的形成，只有这种单分子层磷脂才能使表面张力降低到最低水平。

在本实验中我们发现，气管内灌注BLM后肺组织SP-A、SP-B和SP-C mRNA表达水平降低。表明BLM诱发大鼠肺纤维化时Ⅱ型上皮细胞的功能发生了改变。我们推测BLM引起Ⅰ型上皮细胞变性、坏死，Ⅱ型上皮细胞增生，但Ⅱ型上皮细胞的功能则滞后。随着Ⅱ型上皮细胞向Ⅰ型上皮细胞的分化和肺泡的重建，Ⅱ型上皮细胞的功能也渐恢复，表达SPs也渐增多。Mccorman等^［6］发现，IPF患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A/PL（总磷脂）低于健康者，且与预后明显相关。SP-A/PL高于中位水平的患者其5年生存率低于中位水平患者的2倍以上。有趣的是，肺纤维化时表面活性物质磷脂成分合成往往增加^［7］。体外实验显示，SP-A能通过反馈机制阻断Ⅱ型上皮细胞分泌磷脂酰胆碱（占磷脂总量的80％），不难想象，肺纤维化时SP-A表达减低，对Ⅱ型上皮细胞分泌磷脂的抑制作用亦将减低；故磷脂成分将增加。由于本实验未测磷脂，因此有待进一步<