结核分支杆菌(MTB)耐药性的出现是困惑结核病治疗的主要原因，许多感染了耐药性MTB的患者，因缺乏有效的治疗手段而使病情加重甚至死亡。异烟肼(INH)是抗结核治疗中最主要的药物之一，是多种药物联合化疗治疗结核病最基本的组成部分。MTB对INH的耐药性问题备受关注，揭示抗结核药物耐药的机制，创建一种对临床分离菌进行耐药性快速检测的有效手段，是目前迫切需要解决的问题。随着分子生物学技术的不断发展，新近几年用于MTB耐药基因检测的方法日趋成熟，为从分子水平上探明MTB的耐药机制奠定了基础^［1，2］。在目前有关MTB耐INH的分子生物学机制研究中，是以katG基因的研究为热点，本文中仅就此作一综述。

一、katG基因的结构

katG基因是MTB染色体中的一功能区段，虽然MTB全基因序列目前尚在研究中，但katG基因的结构已很清楚。它的上游相隔44个碱基与furA基因相连^［3］，下游相隔2 794个碱基与embC基因相连。应用kpnⅠ限制性内切酶对MTB INH敏感标准株H₃₇Rv进行消化后，得到一个大约4 810bp的DNA片段，它作为开放可读框架存在被分析时，具有高度编码概率价值。katG基因就位于该片段的第1 979～4 201位，全长2 223 bp，其中A428 bp，C 696 bp，G 740 bp，T 359 bp，C+G占64.6%。将此片段转染到一个能在500 μg/ml INH中生长的耻垢分支杆菌中，结果使后者获得了对INH的敏感性(MIC为8～32 μg/ml)，而对其他药物的MIC不变，证实了此DNA序列确是katG基因，它与MTB对INH的耐药性呈直接相关^［4，5］。Cookerill以及Klin等对MTB的ATCC 25 618株的katG基因分析时也发现，katG基因含有2 223个核苷酸，除了第700位一个碱基由鸟嘌呤取代了胞嘧啶(它们的产物均为甘氨酸)之外，与H₃₇Rv株的核苷酸种类和顺序都是一样的。但当他们对MTB的H₃₇Rv-MC株和ATCC 27 294株进行katG基因分析时，则发现它们与H₃₇Rv株的katG基因序列至少存有16个碱基的差异。因此，在进行katG基因的研究，选择MTB标准对照株时，应充分考虑不同菌株间基因差异的可能性，尽量选用通用的标准株——H₃₇Rv株。在对katG基因进行分子学检测，尤其是聚合酶链反应(PCR)或DNA杂交检测时，其引物和探针的设计应尽可能地避开katG的变异区域。

二、katG基因的同源性和功能

许多微生物都含有katG基因，它们与MTB基因有较高的同源性。Heym等^［6，7］用一个携带着来自MTB katG基因的探针进行杂交分析，结果MTB H₃₇Rv株和麻风分支杆菌等6株分支杆菌均可见有亮度不同的杂交带。应用氨基酸序列分析显示，MTB katG基因编码的过氧化氢-过氧化物酶，与胞内分支杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌、芽孢杆菌属的嗜热脂肪杆菌编码的过氧化氢-过氧化物酶，其氨基酸残基符合率为60%、53.3%、45.7%，与来自啤酒酵母菌的细胞色素C也有部分同源性，表明katG基因的分布是非常广泛的。katG基因编码产生heme-conting酶，也称为过氧化氢-过氧化物酶，酶分子量为8 000，在细菌的氧化代谢过程中发挥重要作用。虽然katG基因广泛存在于其他微生物中，但众所周知，INH通常只对MTB野生株有效，MIC多在0.02 μg/ml；对绝大多数的其他分支杆菌的效果就差得多，如耻垢分支杆菌最小抑菌浓度(MIC)为32 μg/ml；而其他种属的细菌对INH是不敏感的。存在这种现象的机制除了INH靶部位——分支菌酸分布的种属特异性外，分子生物学的解释^［5］是：katG能表达两种过氧化酶，一个是由katG基因N端编码产生的作用范围广泛的酶，赋予过氧化物酶活性；另一个是由katG基因C端编码产生的过氧化氢酶。由于katG基因结构的差异，导致绝大多数细菌所产生的过氧化氢酶能优先去除过氧化氢，从而限制了过氧化氢-过氧化物酶对INH的氧化，INH不能转化为毒性结构，使菌体对INH不敏感。而MTB，由于其katG基因编码的过氧化氢酶，缺乏优先去除过氧化氢的能力，因而可转变INH成为致死性的药剂。将MTB的katG基因转染到耻垢分支杆菌和大肠杆菌中，则两种菌均表现出对INH的敏感性。说明MTB的katG基因与其他生物体的katG基因，不仅存有结构上的差异，更表现为功能上的不同。

三、katG基因缺失与INH耐药

katG基因与INH耐药关系的最初研究结果表明INH耐药与该基因的完全缺失有关。Zhang等^［4］发现许多耐INH的MTB分离株已降低了过氧化氢酶的活性，其中具有较高耐药(MIC＞50 μg/ml)的分离株已完全为过氧化氢酶阴性。为了在分子水平上检测此现象，他们用经kpnⅠ消化的含有katG基因的限制性片段对耐药性MTB进行Southern杂交 ，两个高耐药MTB中没有一个杂交阳性，而在低耐药菌株(MIC≤1.6 μg/ml)和敏感株中则杂交阳性。提示高耐药株过氧化氢-过氧化物酶活性丧失是因为它的编码基因-katG基因的缺失造成。Rouse和Merris^［7］应用美国PE公司设计的包含katG基因-56～2 220 bp全长的11套引物对MTB进行PCR扩增，在5个高度耐药(MIC为50 μg/ml)菌株中，有1株未在任何一套引物的PCR中产生扩增带，提示该菌的katG基因已完全缺失。随后的许多研究结果都表明，katG基因的完全缺失，可在许多高度耐药MTB中发现，并且其过氧化氢-过氧化物酶活性全部是阴性^［8～10］。因此从分子生物学角度来说，可以将MTB katG基因的完全缺失，作为MTB对INH耐药的一个绝对指标。

四、katG基因突变与INH耐药

随着研究的深入，katG基因完全缺失的发生率，只占临床分离INH耐药株的20%以内，而大部分对INH耐药的MTB仍存有katG基因。将katG基因的功能拷贝转染到INH耐药菌株中，使后者产生了与katG探针杂交阳性的结果，但没有过氧化氢-过氧化物酶活性的表达^［11］。这说明在MTB耐INH的机制中，除了katG基因的完全缺失外，尚有其他改变的存在。O′Brien等^［12］应用PCR技术对30株INH耐药和28株INH敏感的MTB进行分析，在耐药菌株中仅有2株出现katG基因的完全缺失，而所有敏感株则都有katG的5′端和3′端的PCR产物。Altamirano等^［10］对MTB katG基因分析时发现，在9株对INH耐药MTB中，只有1株不产生katG基因的PCR扩增带，提示该基因完全缺失。经PCR产物的碱基序列测定分析显示，其滞留时间为145分钟，而作为对照的INH敏感株的滞留时间为135分钟，显示katG基因存有突变，突变类型包括1个碱基或更多碱基的缺失，多达3个bp的插入，3～38个bp的错配等。我国张宗德等^［13］采用Stoeckle等设计的一对引物对46株临床分离的MTB进行PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析，16个敏感株和30个耐药株均出现katG-PCR扩增带，显示无katG基因的缺失。经SSCP分析发现，16个敏感株无突变，17个存有katG突变的菌株均为INH耐药株，并且与INH的耐药程度密切相关，20个低耐药株(MIC 1μg/ml)突变率为35%，而高耐药株(MIC 10～50μg/ml)突变率为100%。由此可见，katG基因突变较完全缺失是MTB发生INH耐药的更为常见的原因。

五、katG基因中与INH耐药密切相关的密码子

在MTB katG基因中存在着大量结构和功能氨基酸残基密码^［7，14］。密码子104、409、463位的精氨酸，107、321位的色氨酸，108、270、276位的组氨酸，138位的天冬酰胺，275位的苏氨酸，315位的丝氨酸和381、695位的天冬氨酸都是这样的位点。它们可能是过氧化氢-过氧化物酶的结合点或是构成活性基因的必不可少的部分。已证实发生在密码子275位的苏氨酸(ACC)被脯氨酸(CCC)取代的单一突变，即可使过氧化氢-过氧化物酶活性丧失，INH敏感性降低。密码子108位的组氨酸，138位的天冬酰胺的突变也可产生类似的结果。Pretorius等^［15］对耐药MTB katG基因进行PCR-SSCP和DNA序列分析时发现：密码子275位的苏氨酸、409位的精氨酸和695位的天冬氨酸突变为丙氨酸，463位精氨酸突变为亮氨酸，将导致katG基因功能紊乱，出现对INH的耐药。应用位点直接诱变技术^［14］来改变野生型katG基因中13个密码子，对这些部位发生突变的意义进行评价，结果13个密码子中的9个出现点突变时，能引起耐药变异，并且过氧化氢-过氧化物酶活性与INH耐药呈负相关。这些突变即降低了过氧化氢酶的活性，也降低了过氧化物酶的活性。在katG基因突变中，密码子463位的精氨酸(CGG)向亮氨酸(CTG)的突变是最为常见的^{［16，17］}。在评价MTB在此位点的突变对INH耐药方面意义时尚存有不同观点。有学者^［16］认为，此位点是katG基因重要的功能区段，决定着过氧化氢-过氧化物酶的活性。而Shirn等^［17］的观点与此不同，他在对50株MTB分析时发现，78%的耐药株和61%的敏感株都存有此突变，在分布上无任何具有统计学意义的差异。提示该位点的CGG向CTG的改变可能是MTB一个多样性结构，它们之间的转变与MTB对INH耐药无关。应用位点直接诱变试验^［18］也证实，在密码子463位的精氨酸向亮氨酸的突变，不改变过氧化氢-过氧化物酶的活性，与INH耐药无关。

总之，MTB的katG基因是一2223 bp的核酸片段，不同的MTB株，即使是标准菌株其katG基因中也可以存有少量差异，这在我们的引物和探针的设计时应加以考虑。MTB的katG基因与大肠杆菌等有较高的同源性，但由于MTB katG基因结构和功能的特异性，使MTB对INH呈独特的敏感性。在评价katG基因变异与MTB耐INH的关系方面，该基因的完全缺失可以作为MTB发生耐药的一个绝对指标。除缺失外，katG基因突变是导致INH耐药的主要原因，但突变所造成的影响，要看基因序列改变的位点在katG表达中所起作用的轻重。一些决定着表达酶的结合位点和活性基因的碱基出现突变，必然严重制约了过氧化