应用Northern印迹杂交和免疫细胞化学方法观察血小板源性生长因子(PDGF)对离体大鼠肺成纤维细胞(LF)整和素α₅β₁和纤维连接蛋白(FN) mRNA及其编码蛋白表达的影响，探讨PDGF在肺纤维化中的作用。

材料与方法(1)选择体重150～200 g SD大鼠，根据Kummar^［1］的方法分离、培养LF。(2)将第4～15代LF接种于96孔板(10⁴/孔)，用无血清培养液培养48小时，然后分别加入浓度为0～25 μg/L的PDGF-BB液，培养72小时后加入四唑盐(MTT)，用酶标检测仪读出每孔A值(曾称光密度OD值)，观察PDGF对LF生长的影响。(3)LF用无血清培养液培养48小时后加入10 μg/L的PDGF-BB，分别培养0～48小时收集细胞，采用Chomczynski改良法抽提细胞总RNA，甲醛变性凝胶电泳后作Northern印迹转移，以α-³²P-dCTP-随机引物法标记整合素α₅β₁和FN cDNA探针进行杂交，放射自显影杂交带作图像分析读出A值。(4)生长于盖玻片上的LF在含有PDGF-BB(10 μg/L)无血清培养液中分别培养6、12、24小时后，经中性缓冲液甲醛固定，用兔抗α₅β₁(Gibco brl)、FN(Dako)作免疫细胞化学染色(PAP法)，每张玻片随机取100个细胞作图像分析，读出A值。

统计学处理采用t检验分析。

结果(1)PDGF对LF生长的影响：MTT法显示PDGF可以明显刺激LF生长，PDGF浓度在1～10 μg/L之间时呈剂量依赖性，A值最高时可达对照的4.5倍。(2)PDGF对LF整合素α₅β₁和FN mRNA表达的影响：Northern印记杂交显示PDGF可以增强α₅β₁、FN mRNA的表达。PDGF作用2小时后即强于对照组，以后继续增强，18小时略有回落，但随后又继续增强，直至实验结束。(3)PDGF对LF整合素α₅β₁和FN蛋白表达的影响：对照组和PDGF作用6、12小时的LF，对α₅β₁、FN特异性抗体均呈弱阳性反应。PDGF作用24小时α₅β₁和FN表达增强，其胞浆呈明显的棕黄色阳性反应，图像分析显示，FN的平均A值为78(对照组为15),α₅β₁的平均A值为50(对照组为11)，P＜0.01。

讨论研究结果表明，PDGF-BB可以促进LF分裂增殖，这种促增殖作用,在1～10 μg/L之间时呈剂量依赖性。LF的迁移、增生以及ECM(FN、胶原等)的合成和分泌在肺纤维化发生发展过程中起着非常重要作用。我们以往的研究发现，在体外PDGF具有促进LF肺成纤维细胞增殖和胶原合成的作用^［2］，本组实验结果显示，PDGF作用2小时后就能明显增强FN及其受体α₅β₁的表达，这种作用不仅表现为蛋白合成增加，而且还表现在mRNA转录水平的增强。结果提示PDGF促进肺间质纤维化的作用可能与其增强FN及其受体的表达有一定的关系。PDGF如何调控α₅β₁及其FN mRNA表达的机制尚不清楚，文献报道细胞因子对整合素表达的调节作用可能通过多种途径，鉴于细胞因子作用后LF磷酸酪氨酸表达增强^［3］，提示α₅β₁和FN表达的调节信息的传递有可能与酪氨酸的磷酸化有关。

本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：3933014)

参考文献

1Kummar RK, Bennett RA, Brody AR. A homologue of palatelet-dervied growth factor producted by rat alveoloar macrophages. Faseb J, 1988, 2:2272-2277.

2吴浩，张月娥，许祖德，等. 血小板源性生长因子对肺纤维母细胞前胶原合成的影响. 上海医科大学学报, 1996, 23:199-201.

3周晓虹、张月娥、张秀荣，等. β₁型转化生长因子对大鼠肝Ito细胞整合素α₅、β₁表达的调节. 中华医学杂志，1997,77:539-540.

(收稿：1997-10-06修回：1998-01-13)