关键词： 肺肿瘤；腺癌；细胞系；转染；HSV-TK基因；基因治疗

【摘要】目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因在肺腺癌基因治疗中的应用。方法对转导了HSV-TK基因的感染人肺腺癌细胞A549(A549/TK)和野生型A549，采用噻唑蓝(MTT)法测定不同浓度丙氧鸟苷(GCV)作用72小时后的细胞存活率，求得半抑制浓度(IC₅₀)。动物实验将9×10⁶的A549/TK或野生型A549细胞接种于Balb/c nu/nu裸鼠的皮下，当肿瘤长至200～300 mg时，随机分组。A549/TK组(1组)荷瘤小鼠给予每天100 mg/kg GCV腹腔注射，连续给药2周，对照组(2组)A549/TK给予生理盐水，野生型A549组(3组)给予等量GCV，从给药开始之日起，每周二次测量肿瘤大小，按经验公式计算肿瘤相对重量。结果体外细胞毒实验：在20μmol/L GCV存在时，野生型A549形态无明显改变，而实验组细胞明显死亡。GCV对野生型A549的IC₅₀为500μmol/L，对A549/TK的IC₅₀为0.5 μmol/L，二者相差1000倍(P＜0.01)。动物实验：腹腔注射GCV可使A549/TK皮下肿瘤显著缩小。从注射之日起到17天时，肿瘤体积下降了92%，而GCV对野生型A549肿瘤无效，在相同时间内肿瘤体积增加了3.9倍。两者比较，差异具有显著性(P＜0.01)。结论HSV-TK/GCV系统在肺癌基因治疗中具有显著作用，显示了其潜在的临床应用价值。

Experimental studies on human lung cancer gene-therapy with HSV-TK/GCV system

Sha Huifang, Wang Enzhong, Bao guoliang, et al. Shanghai Chest Hospital, Shanghai 200030

【Abstract】ObjectiveEvaluate the clinical potential of HSV-TK/GCV system in gene-therapy of tumors by using this system to treat human lung cancer A549 cells in vitro and in vivo. MethodThe in vitro sensitivity levels of A549/TK (TK-tranfered A549) cells and wild type A549 cells to GCV were expressed as IC₅₀ which was measured with MTT assay after treating both cells for 72 hrs. In vivo study, The nude mice bearing A549/TK tumor or A549 tumor were used as experimental models. All the animals were divided into 3 groups. Group 1, the animals bearing A549/TK tumor would be treated with GCV. Group 2, The animals bearing A549/TK tumor would be treated with saline. Group 3, The animals bearing A549 tumor would be treated with GCV. When the tumors reached to 200～300 mg the animals would be injected intraperitoneally with GCV solution (100 mg^.kg^-1.day^-1) or equal volume of saline for two weeks. In this period and the following four weeks, the tumor weights were measured and calculated with the experience formula once every three or four days. ResultIn vitro study showed that the a549/TK cells were apparently killed in a 20 μmol/L GCV solution while the wild type A549 cells grew normally under the same condition. The IC₅₀ of A549/TK cells in GCV solution was 0.5 μmol/L and that of A549 cells 500 μmol/L, showing a 1 000 fold difference (P＜0.01). In vivo experiment GCV had compelled the A549/TK tumors to lead to a regression of 92%, meanwhile the A549 tumors treated with GCV increased 3.9 times in weight in the first seventeen days of experiment. Group 2 tumors A549/TK tumors which were treated with saline, grew as well as group 3 did. There was a significant difference (P＜0.01) between group 1 and other groups. ConclusionGCV could specifically and effectively kill the TK-transfered A549 cells in vitro and in vivo. This result suggested that the HSV-TK/GCV system may have a clinical potential for gene therapy of lung cancer.

【Key words】Lung neoplasmAdenocarcinomaCell lineTiansfectionHSV-TK geneGene therapy

基因治疗的出现为恶性肿瘤治疗提供了一个新的手段。自1992年以来，美国学者利用逆转录病毒载体，将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因直接导入恶性脑瘤，治疗了10例患者，其中6例生存期显著延长^［1］显示HSV-TK基因治疗肿瘤可能有临床应用的前景。我们以下报道HSV-TK基因在肺腺癌基因治疗中的应用并对其价值进行探讨。

材料与方法

1.含HSV-TK基因的逆转录病毒质粒的包装及感染人肺腺癌细胞A549，见文献^［2］。

2.野生型A549和A549/TK体外细胞毒实验：用噻唑蓝(MTT)法^［3］测定不同浓度丙氧鸟苷GCV(0、1、10、100、1 000 μmol/L)培养72小时后的细胞存活率，每组设置4个重复孔，以细胞存活率对GCV浓度作图，求得半抑制浓度(IC₅₀)。

3.动物实验：Balb/cnu/nu裸鼠购于上海肿瘤研究所动物中心，雌性，6周龄，每组为4只，在裸鼠的右前肢腋侧皮下，接种9×10⁶的A549/TK或野生型A549，6周后，当皮下肿瘤长至重量为200～300 mg时，随机分为三组。1组为A549/TK组：A549/TK荷瘤裸鼠给予每天100 mg/kg的GCV，腹腔注射，连续给药2周。2组为对照组：A549/TK荷瘤裸鼠给予同剂量生理盐水腹腔注射。3组为野生型A549组：给予野生型A549荷瘤裸鼠同剂量GCV腹腔注射。从给药开始之日起，每周二次测量肿瘤大小，按经验公式^［4］计算肿瘤重量。

4.实验结果采用t检验和u检验进行统计学分析。

结果

一、体外细胞毒试验

在20 μmol/L GCV存在时，野生型A549细胞形态无明显改变，而A549/TK细胞形态却发生明显改变，细胞整体轮廓模糊，细胞膜变形，细胞内出现很多颗粒状物质及空泡，细胞间出现丝状纤维，并有细胞碎片出现，呈现死亡状。

二、GCV对野生型A549及A549/TK细胞杀伤的IC₅₀比较

GCV对野生型A549细胞的IC₅₀为500 μmol/L，而对A549/TK的IC₅₀为0.5 μmol/L。HSV-TK基因的导入使野生型A549细胞对GCV的敏感性提高了1 000倍，差异具有显著性(P＜0.01)，见图1。

三、GCV对野生型A549及A549/TK细胞形成皮下肿瘤的杀伤效应

腹腔注射GCV后，A549/TK皮下肿瘤不断缩小，从注射之日起到17天时，肿瘤体积缩小了92%，而对照组肿瘤不断增大至注射开始时的3.9倍，两者比较，差异有显著性(P＜0.01)，见图2。分析GCV对野生型A549皮下肿瘤的影响，图3结果表明，GCV治疗不能抑制野生型肿瘤生长。提示GCV对转基因细胞具有良好的选择性。

图1GCV对野生型A549和A549/TK细胞的IC₅₀抑制浓度

图2腹腔注射GCV对A549/TK细胞的杀伤效应

图3腹腔注射GCV对野生型A549细胞的杀伤效应

讨论

肺部肿瘤属较难治疗的实体瘤之一，大部分腺癌对化疗、放疗不敏感，为此人们积极寻找手术、化疗、放疗以外的治疗新方法。HSV-TK可催化核苷类似物GCV的磷酸化。正常情况下，GCV对哺乳动物细胞无明显的毒性，而磷酸化的GCV在极低浓度下就有明显的毒性，因此将HSV-TK基因转入肿瘤细胞可使其对基本无毒的原药产生高度敏感性，导致这些细胞的破坏，产生自杀效应，美国FAD已经批准将这种系统用于恶性肿瘤的基因治疗试验。

我们探讨了利用HSV-TK/GCV系统进行了人肺腺癌移植瘤基因治疗的可能性，实验结果表明：HSV-TK基因的导入对人肺腺癌细胞A549的形态、体外生长均无明显影响，但使转基因细胞对原药GCV的敏感性与野生型A549细胞相比提高了1 000倍，腹腔注射GCV可使转录基因肿瘤明显缩小，但对野生型肿瘤基本无效。提示HSV-TK/GCV系统在肺癌基因治疗中具有极为显著的疗效。

参考文献

1Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, et al. In vivo gene transfer with retroviral vectorproducer cells for treatment of experimental brain tumors. Science, 1992,256：1550-1557.

2沙慧芳，戈凯，刘新垣，等.转TK基因的人肺腺癌细胞对GCV、ACV、BVDU敏感性的研究.上海第二医科大学学报，1997，17：439-441.

3李秀森.MTT比色法检测细胞存活和淋巴因子.免疫学杂志，1992，8：67-71.

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