关键词： 一氧化氮；哮喘；淋巴细胞

【摘要】目的探讨内源性一氧化氮(NO)与支气管哮喘(哮喘)气道炎症以及淋巴细胞免疫调节的作用。方法应用鸡卵清蛋白(OVA)腹腔致敏和反复超声雾化吸入刺激复制大鼠过敏性气道炎症模型。随机分为正常对照组(A组6只)；阳性对照组(B组6只)给予OVA致敏，但不用N^ω-硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)或左旋精氨酸(L-arg)，以生理盐水代之；用药组(C、D组各4只)，每天给予OVA雾化前分别给予300 mg/kg的L-arg或30 mg/kg的L-NAME腹腔注射。研究内源性NO对气道炎性细胞浸润、气道淋巴细胞膜表面白细胞介素2受体(mIL-2R)表达以及脾淋巴细胞增殖和脾淋巴细胞mIL-2R表达的影响。结果体内实验表明，正常大鼠(6只)支气管粘膜下未见嗜酸性粒细胞(EOS)，而致敏大鼠(6只)支气管粘膜下EOS［23±5(平均每视野计数，下同)］、淋巴细胞(34±5)和浆细胞急剧增多，mIL-2R阳性细胞增多(12±3)。NO合成抑制剂(NOS，4只)可使致敏大鼠气道EOS(13±3，P＜0.05)、淋巴细胞(28±4)和mIL-2R阳性细胞(4.3±1.6，P＜0.05)减少，可使脾细胞增殖减慢(P＜0.05)，mIL-2R阳性的脾细胞减少(P＜0.05)。而NO合成前体则有使EOS、淋巴细胞和mIL-2R阳性细胞进一步增多的趋势。体外实验证明NOS合成抑制剂于体外培养时能抑制脾淋巴细胞的增殖(P＜0.05)及其mIL-2R的表达(P＜0.05)。低剂量NO合成前体促进脾淋巴细胞的增殖及其mIL-2R的表达，而较高剂量时其作用则相反(均为P＜0.05)。结论一定水平的内源性NO与过敏性气道炎症大鼠淋巴细胞的增殖及激活有关。

Effects of nitric oxide on the airway inflammation and lymphocyte proliferation in sensitized rats

Xue Jianmin, Xu Yongjian, Zhang Zhenxiang, et al. Department of Respiratory Disease, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relations between intrinsic nitric oxide (NO) and airway inlammation and lymphocyte proliferation in bronchial asthma.MethodThe rat model of asthmatic airway inflammation was established by first sensitizing and then challenging the animals with ovalbumin. NO synthase (NOS) inhibitor and NO precursor were then applied and their influences on the airway inflammatory cell numbers and on the numbers of mIL-2R positive lymphocytes were observed.ResultIn vivo experiments showed that normal control rats (n=6) did not have eosinophils in their submucosal of airways while in the sensitized animals (n=6) eosinophils ［23±5 (average cell counts per microscopic visual field, the same below) as well as lymphocytes (34±5) and mIL-2R positive cells (12±3) were found in significantly increased numbers in the airways. The application of NOS inhibitor significantly reduced eosinophils (13+3, P＜0.05) and mIL-2R positive cells (4.3±1.6, P＜0.05) in the sensitized animals and the number of lymphocytes was also decreased (28±4) although it did not reach the significant level. At the same time the spleen cell proliferation was inhibited (P＜0.05) and the mIL-2R positive spleen cell numders were reduced (P＜0.05). On the contrary, the application of NO precursor resulted in the further increase of the numbers of eosinphils, lymphocytes and mIL-2R positive cells although the differences were not statistically significant. In vitro experiments showed that NOS inhibitor inhibited the proliferation of cultured spleen lymphocytes as well as their mIL-2R expression (P＜0.05). NO precursor, when used in low dose, could promote the proliferation and mIL-2R expression of spleen cells (P＜0.05); but high dose of it showed inhibiting effect on the spleen cells (P＜0.05).ConclusionIntrinsic NO at a suitable level is important in the regulation of the proliferation and activation of lymphocytes in the airways with allergic inflammation in the sensitized rats. This research is conducive to the understanding of the pathogenesis of the asthmatic airway inflammationand to investigating of new therapeutic approaches.

【Key words】Nitric oxideAsthmaLymphocytes

哮喘是包括肥大细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞在内的多种炎性细胞参与的气道慢性非特异性炎症。在炎症发生过程中淋巴细胞起关键性作用。Robinson等^［1］已证实哮喘患者存在T细胞活化, 尤其是CD⁺₄辅助T细胞2(Th2)的激活,其异常分泌的细胞因子参与哮喘炎症的形成^［2］。但活化机制不详。NO具有多种生物作用的小分子信息分子,有重要的免疫调节功能,已发现NO作为一种介质参与类风湿性关节炎等自身免疫性疾病发病, 影响淋巴细胞的活化增殖^［3］,但关于内源性NO对哮喘气道炎性细胞浸润及淋巴细胞激活有何影响研究尚少。我们拟对内源性NO在哮喘气道炎症发病中的作用及与淋巴细胞功能的关系进行研究, 以便为进一步阐明哮喘的发病机制和探索新的治疗途径提供实验资料。

材料与方法

1.药品与试剂:刀豆蛋白A(Con A)、N^ω-硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)、鸡卵清蛋白(OVA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均为Sigma产品, 左旋精氨酸(L-arg)为上海伯奥生物科技公司产品, RPMI 1640培养粉为Gibco公司产品, 二甲基亚砜(DMSO)为Merck公司产品, 氢氧化铝［AL(OH)₃］为上海金山化工厂产品,百日咳杆菌疫苗由上海生物制品研究所提供,小鼠抗大鼠白细胞介素2受体(mIL-2R)及碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)试剂盒购于北京邦定生物制品公司, 生物素标记的羊抗小鼠抗体及过氧化物酶标记的亲和素购自武汉博士德生物工程有限公司。

2.体内实验:雄性SD大鼠20只,体重200±45 g,2～3月龄,由同济医科大学实验动物中心提供。随机分为4组:A组(6只)为正常对照组,以生理盐水代替抗原进行注射和雾化吸入; B组(6只)为阳性对照组, 给予OVA致敏和刺激,但不用L-NAME或L-arg,以生理盐水代之;C、D组(各4只)为用药组, 每天予1%OVA雾化吸入前分别给予300 mg/kg的L-arg或30mg/kg的L-NAME腹腔注射。B、C、D 组大鼠的致敏及刺激参照文献^［4］方法进行,腹腔注射OVA 1 mg、灭活百日咳杆菌疫苗5×10⁹个和AL(OH)₃干粉100 mg，2周后雾化吸入1% OVA激发。3组均出现呼吸困难，C组最重，D组较B组略轻。雾化后第7天给予0.4mg%戊巴比妥4mg/kg麻醉,开胸取右肺组织,用于HE染色。以400×光镜下逐个视野观察，计数支气管粘膜及粘膜下EOS、淋巴细胞细胞数，计算每视野平均值。(1)亲和素-生物素-过氧化物酶(ABC)法测大鼠肺组织mIL-2R阳性细胞：取右肺中叶组织用-20℃恒冷切片机制成20μm切片,冷丙酮4℃固定10分钟后, 用ABC法^［5］进行肺组织mIL-2R阳性细胞染色。以磷酸盐缓冲液(PBS)取代羊抗鼠血清,作为空白对照。以400×光镜下计数支气管粘膜及粘膜下mIL-2R阳性细胞(棕色)数，计算每视野平均值。(2)脾细胞Con A及OVA增殖反应:无菌操作下取出大鼠脾脏,制备脾细胞悬液, 采用MTT比色微量分析法测定脾细胞Con A及OVA增殖反应^［6］。Con A的终浓度为20 mg/L, OVA的终浓度为200 mg/L,结果以吸光度值(A值，曾称光密度OD值)表示,均设复孔及对照孔。增殖反应净增殖值=刺激值均值-自发增殖均值。(3)脾细胞mIL-2R阳性细胞测定:将脾细胞置于24孔培养板, 每孔2×10⁶细胞,每只大鼠均培养3孔,其中1孔为对照,另2孔分别加入终浓度为200 mg/L的OVA或终浓度为20mg/L的Con A, 细胞置于37℃、5%CO₂培养箱培养48小时,培养细胞用PBS调至1×10⁶/ml,采用APAAP法^［7］测定mIL-2R。计数200个脾细胞,以每100个细胞所占阳性细胞表示。

3.体外实验:(1)大鼠的处理包括OVA致敏和刺激, 其过程与体内实验中阳性对照组(B组)完全相同。(2)淋巴细胞分离和培养:制备脾脏细胞单细胞悬液后, 分离出淋巴细胞, 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 调整细胞浓度至2×10⁶/ml,接种于24孔细胞培养板, 每孔1 ml, 各加入终浓度为200 mg/L的OVA作为特异性刺激物。(3)L-NAME、L-arg实验:①上述细胞分别加入终浓度为0、1×10^-1mmol/L、5×10^-1 mmol/L、1 mmol/L的L-arg;5×10^-2 mmol/L、5×10^-1 mmol/L、1 mmol/L的L-NAME及5×10^-1 mmol/L L-arg+5×10^-1 mmol/L L-NAME,于5%CO₂、37℃培养箱培养48小时, 采用APAAP法测mIL-2R阳性细胞,每一浓度均设复孔及对照孔。②上述每组细胞均在不同药物浓度下用MTT微量比色法测定OVA刺激增殖反应。

4.统计学处理以±s表示,组间比较用t检验或方差分析。两变量的相关程度用直线相关分析。

结果

一、体内实验

1.OVA致敏哮喘大鼠模型肺组织HE染色：细支