关键词： 表皮生长因子受体；单克隆抗体；肺腺癌

【摘要】目的观察表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体对人肺癌细胞体外增殖的作用，探讨其在肺癌抗体生物治疗中的应用价值。方法应用杂交瘤技术制备EGFR单克隆抗体并以噻唑蓝(MTT)比色法检测EGFR单克隆抗体对人肺癌细胞体外增殖能力的影响。结果EGFR单克隆抗体对人肺腺癌SPC A-1和A549细胞体外增殖有显著的抑制作用，但对小细胞肺癌SH-77和NCI-H446细胞的生长无明显影响。抗体浓度为15 μg/ml时，SPC A-1和A549细胞的生长率仅为对照组的6%和12%。结论EGFR单克隆抗体在肺腺癌的生物治疗中具有潜在的应用价值。

The growth inhibition of anti-EGF receptor monoclonal antibody to human lung adenocarcinoma cells

Chen Xiaodong,Zhang Shangquan,Bai Chunxue,et al.Institute of Respiratory Diseases,Zhongshan Hospital,Shanghai 200032

【Abstract】ObjectiveEpidermal growth factor (EGF) and its receptor play a critical role in the growth and regulation of many type of malignant cell. The high level of expression of the EGFR on nonmall cell lung cancer(NSCLC) and the important role of EGFR in signal transduction make it potentially an excellent target for antibody directed therapy.The purpose of this study was to evaluate the anti-tumor effects of anti-EGFR monoclonal antibody on lung cacinoma cells.MethodPreparation of hybrid cell producing anti-EGFR monoclonal antibody using EGF receptors partially purified from A431 cells as immunogen.The effect of anti-EGFR monoclonal antibody to human lung cells was investigated in vitro.ResultThe anti-EGFR monoclonal antibody was shown to inhibit the proliferation of human lung adenocarcinoma cells in vitro,but no growth-inhibitory effect was observed in the human small cell lung cancer cells.The concentration,15 ug/ml,of anti-EGFR antibody could inhibit growth rate by 94% and 88% for human lung adenocacinoma cell lines SPC A-1 and A549, respectively.ConclusionOur initial results indicate that the anti-EGF receptor monoclonal antibody may be potentially useful for the biotherapy of lung adenocarcinoma.

【Key words】Epidermal growth factor receptorMonoclonal antibodyLung adenocarcinoma

表皮生长因子受体(EGFR)是一种由癌基因CerbB₁编码的分子量为170 000的跨膜糖蛋白，具有内源性酪氨酸激酶活性，在一些恶性肿瘤的发生发展过程中起关键作用^［1］。应用EGFR单克隆抗体阻断表皮生长因子类物质对癌细胞的自分泌或旁分泌作用，有可能抑制癌细胞的增殖和分裂，因而EGFR近年来已成为肿瘤抗体生物治疗研究的理想靶点之一^［2］。我们报道EGFR单克隆抗体对人肺癌细胞体外增殖的作用，探讨EGFR单克隆抗体在肺癌生物治疗中的应用价值。

材料与方法

1.EGFR单克隆抗体的制备：EGFR单克隆抗体制备参照Kawamoto等^［3］介绍的方法。收集体外培养的人上皮癌细胞株A431细胞制备溶浆，反复经表皮生长因子(EGF)亲和层析柱(本实验室自制)提取EGFR。常规免疫BALB/c小鼠(6周龄，雌性)，取其脾细胞以50%聚乙二醇4 000作为促融剂与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。用有限稀释法进行克隆，采用的检测法为¹²⁵I-EGF竞争结合抑制试验，并多次克隆化。获得杂交瘤细胞株后常规制备腹液，用FPLC仪经Protein G柱(Pharmacia公司生产)纯化分离单克隆抗体。

2.EGFR单克隆抗体的鉴定：用¹²⁵I-EGF结合抑制试验进行鉴定。方法如下：在96孔培养板各孔中加入50 μl经细菌过滤的纯化抗体(最高浓度为60 μg/ml，400 nmol/L)，然后加入50 μl的¹²⁵I-EGF［每孔每分钟闪烁计数值为(2～3)×10⁴］，对照孔以50 μl的PBS代替抗体，每样本孔设3个复孔。吸取100 μl的A431细胞悬液(10⁵细胞/毫升)至上述各样本孔中。培养板置37℃的CO₂培养箱内培养2小时后各样本孔用PBS洗脱3次，然后收获细胞进行液体闪烁计数(每分钟闪烁计数值代表该孔细胞结合EGF的数量)。

3.EGFR抗体对肺癌细胞体外生长的影响：以人肺腺癌细胞株SPC A-1和A549以及人小细胞肺癌细胞株SH-77和NCI-H446为靶细胞，采用噻唑蓝(MTT)比色法^［4］测定癌细胞的生长率。方法如下：吸取100 μl靶细胞悬液(含10⁴细胞)分别接种于96孔板，置37℃的CO₂培养箱培养4小时后，各治疗孔加入100 μl经细菌过滤的EGFR单克隆抗体(最高浓度60 μg/ml，400 nmol/L)，对照孔加入100 μl的PBS，每个样本孔设3个复孔。培养板置37℃的CO₂培养箱培养72小时后(中间更换含单抗培液1次)以MTT法测定各样本孔在波长570 nm的吸光度(A₅₇₀值)并计算各孔癌细胞生长率。

结果

一、EGFR单克隆抗体的鉴定

采用¹²⁵I-EGF竞争结合抑制试验对所制备的EGFR单克隆抗体进行鉴定，结果表明该抗体明显抑制配体EGF与A431细胞膜EGFR受体的结合能力。抗体浓度在100 nmol/L时抑制率近90%，随着抗体浓度的降低抑制率也相应下降，存在明显的剂量-反应关系(图1)。寇氏法计算EGFR抗体的半数抑制浓度(IC₅₀)约为6 nmol/L。

二、EGFR抗体对肺癌细胞体外增殖的作用

MTT比色法结果显示EGFR单克隆抗体显著抑制2株肺腺癌细胞的体外增殖，但对2株小细胞肺癌细胞的生长无明显影响。抗体浓度为10 nmol/L时肺腺癌SPC A-1、A549和小细胞肺癌SH-77、NCI-H446细胞的生长率分别为对照孔的81%、90%、95%和92%；抗体浓度提高至100 nmol/L时，肺腺癌SPC A-1、A549细胞的生长速率显著下降，为对照组的6%和12%，而小细胞肺癌SH-77和NCI-H446细胞的生长则无明显抑制，为对照组的92%和90%

图1EGFR单克隆抗体的竞争性结合抑制试验(图2)。寇氏法计算EGFR单克隆抗体对肺腺癌SPC A-1和A549的IC₅₀约为18 nmol/L和34 nmol/L。

图2EGFR抗体对人肺癌细胞体外生长抑制试验

讨论

单克隆抗体导向治疗是肿瘤生物治疗的一个主要研究方向^［5］。近几年来随着肿瘤分子生物学研究的发展，一些癌基因的产物已成为肿瘤抗体导向治疗的研究热点，EGFR就是其中之一^［2］。EGFR在一些恶性肿瘤的高度表达及其在细胞信号传递中的重要作用，使其成为抗体导向治疗的理想靶点。我们的实验结果显示，EGFR单克隆抗体能够竞争性地抑制配体EGF与A431细胞膜上EGFR的结合，其IC₅₀仅为6 nmol/L。从中可以看出EGFR抗体通过阻断生长因子与其受体间的反应而具有抑制癌细胞生长的潜在作用。

许多研究表明，非小细胞肺癌均存在EGFR的高度表达，说明EGFR介导的细胞信号传递在非小细胞肺癌的发生发展过程中起重要作用^［6］。Pestana等^［7］检测了6株非小细胞肺癌和5株小细胞肺癌细胞的EGFR表达程度。结果表明，非小细胞肺癌细胞中有5株存在EGFR的表达，小细胞肺癌细胞仅有1株表达EGFR。他们的研究还发现，EGFR单克隆抗体仅对表达EGFR的肺癌细胞具有显著的抑制生长作用，表明EGFR抗体对癌细胞的生长抑制作用是EGFR依赖性的。尽管本组没有检测4株肺癌细胞的EGFR表达状态，但从实验结果可以推测，2株小细胞肺癌细胞的增殖不受EGFR抗体的影响与其低或不表达EGFR有关。因此可以认为，EGFR单克隆抗体对非小细胞肺癌更具有潜在的治疗价值。

EGFR单克隆抗体通过阻断EGFR介导的酪氨酸激酶的活化而调控癌细胞的增殖。Peng等^［8］从分子水平阐明，EGFR表达阳性的癌细胞经EGFR抗体作用后，其细胞周期依赖性激酶2 (CDK2)的活性受到抑制，同时细胞周期依赖性激酶抑制物(CDKI)p27^KIPI的mRNA表达水平提高，从而诱导细胞发生G₁期停滞而使癌细胞增殖受到抑制。此外，EGFR单克隆抗体通过诱导p27^KIPI上调和细胞G₁期停滞也使癌细胞发生凋亡^［9］。

本实验结果证实EGFR单克隆抗体可显著抑制人肺腺癌细胞体外增殖，为探讨EGFR单克隆抗体在肺癌生物治疗中的应用提供了理论和实验基础。

(本工作在中国科学院上海细胞生物学研究所雄性生殖组完成)

本课题受上海市科技发展基金资助(基金编号：954119028)

参考文献

1Ullrich A, Schlesinger J. Signal transduction by recept