肿瘤抑制基因CDKN2也称p16^INK4A、MTS1，自从1994年美国盐湖城Kamb和Kolnick报道以来，受到医学界广泛关注，已成为肿瘤分子生物学、分子遗传学等领域研究的热点。研究表明CDKN2基因与人类多种肿瘤的形成和发展密切相关，是细胞周期调控的固有成分，直接抑制细胞周期素依赖激酶(cyclin dependent kinase, CDK)对视网膜母细胞瘤基因(retinoblastoma gene, Rb)产物Rb蛋白的灭活作用而调控细胞周期。我们对CDKN2调控细胞周期作用机制、CDKN2与人类癌症的关系、CDKN2在肺癌中的失活机制及CDKN2应用前景作一简要综述。

一、CDKN2基因与细胞周期

CDKN2基因定位在人染色体9p21，含3个外显子和2个内含子，全长8.5 kb，其中5′端126 bp组成第一外显子，3′端11 bp组成第3个外显子，中间序列组成第2个外显子，其编码的蛋白质由307个氨基酸组成，分子量为15.84 KD(称p16蛋白)，具有4个回钩状折叠的空间构象，此回钩状折叠与p16蛋白的抑制活性有关，Hirama^［1］等研究发现在p16蛋白回钩状折叠之外的缺失突变不影响p16的功能。当细胞分裂增殖时需要一系列酶和调节蛋白，与细胞周期有关的关键酶是一组类似的丝氨酸/苏氨酸激酶称之为细胞周期素依赖激酶(简称CDK)。对于细胞分裂，CDK必须以极其复杂的方式在细胞周期的特定时间被激活和失活，通常CDK由细胞周期素(Cyclin)激活，而由CDK抑制物灭活。细胞周期素B与Cdc2(即CDK1)复合物的活性是细胞进入M期所必需的，而细胞周期素D与CDK4复合物(cyclin D/CDK4)和细胞周期素E与CDK2复合物(cyclin E/CDK2)的活性对于细胞进入S期是必需的。Cyclin D和Cyclin E的过表达缩短G1期，促使细胞提前进入S期。Cyclin A与CDK2复合物的活性与S期DNA合成有关。Cyclin D主要通过结合并激活CDK4/6的活性，后者使Rb磷酸化，而解除Rb介导的生长抑制作用。

Rb蛋白的磷酸化状态在细胞周期中受到精密调控，在G1期以非磷酸化状态存在，在G1后期直至M期结束Rb蛋白被广泛磷酸化，然后在M后期迅速去磷酸化。非磷酸化状态的Rb蛋白定位在核质中，与E2F转录因子结合，抑制E2F的转录激活作用，抑制DNA转录，从而抑制细胞进入S期，Rb蛋白磷酸化后即失去其对E2F转录因子的隔离作用。当Rb蛋白快速磷酸化时，E2F与对细胞增殖重要的许多基因如二氢叶酸还原酶、胸苷激酶、DNA聚合酶α、Cdc2和c-myc等基因的启动子中E2F结合位点结合，这些基因被激活，在G1/S交界时表达，因而促进细胞增殖。

细胞周期依赖激酶抑制物(Cyclin-dependent kinase inhibitors,简称CDIs)是一组不同于能磷酸化和失活CDK的激酶(Weel/Mikl)的蛋白质，至今包括p21^WAF1/ciplp20^CAP、p27^Kipl、p28^lck、p16^{INK4A/CDKN2/MTS1}、p15^INK4B/MTS2和p18，它们在细胞周期的适当的时刻负调控CDK活性，因此在控制细胞周期进展过程中起关键作用。CDIs之一CDNK2基因产物p16蛋白，能与CDK4和CDK6结合，在G1/S交界时灭活Cyclin D/CDK4的活性，抑制CDK4磷酸化Rb的作用，从而抑制细胞进入S期。CDKs激活物-细胞周期素过表达，能引起细胞生长失控、细胞转化和癌变；CDKs抑制物之一p16蛋白因CDKN2基因缺失、突变、启动子CpG岛异常甲基化等使其表达异常而缺乏或减少，不能灭活CDK4/CDK6活性，同样能导致细胞生长失控、细胞转化和癌变^［2～3］。

二、CDKN2与人类癌症

Kamb、Nobori^［4，5］等研究显示CDKN2基因在人类多种肿瘤来源的细胞系有高频率(约50%)的纯合性缺失，这些肿瘤细胞系包括：85%恶性间皮瘤，82%星形细胞瘤，70%～90%胶质瘤，60%～70%骨肉瘤、食管癌，50%～60%乳腺癌、胰腺癌、肾癌，35%～60%恶性黑色素瘤、头颈癌和白血病，20%～50%膀胱癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤，其中近20%到50%的肺癌细胞系存在CDKN2纯合性缺失。尤其在原发性胶质母细胞瘤、退行性星形细胞瘤和胶质瘤细胞系存在高频率CDKN2纯合性缺失。最近有关原发性肺、膀胱、肾、脑、乳腺和头、颈部癌的CDKN2基因改变的研究显示CDKN2基因突变和缺失的频率与来自相同组织的肿瘤细胞系相比较显著减少，在实体癌标本中观察到CDKN2改变存在于78%的胰腺癌移植瘤(37%缺失，41%突变)、40%～70%的胶质母细胞瘤(纯合性缺失)、52%食管癌(突变)、12%～30%非小细胞肺癌(缺失或突变)、约30%软组织肉瘤和胶质瘤(缺失或突变)、20%的膀胱癌和恶性间皮瘤(缺失)^［1］。多数研究表明在人类癌症中CDKN2最常见的改变是纯合性缺失，基因内突变较少见^［6～7］。但也有少数报道肿瘤中CDKN2点突变频繁。例如Mori等在一食管鳞状细胞癌的研究中显示近50%的食管癌有CDKN2的突变。至今为止神经母细胞瘤细胞系中未检测到CDKN2缺失。

CDKN2基因在人类多种癌肿细胞系及肿瘤组织中缺乏p16蛋白表达，而且研究发现p16蛋白的存在与可检测到的Rb蛋白或Cyclin D1呈负相关，与p53突变无相关性，即在Rb阳性的细胞多缺乏p16蛋白表达，而Rb阴性的细胞多有丰富的p16蛋白表达^［8］。

许多研究者从事了大量的CDKN2与非小细胞肺癌(简称NSCLC)和小细胞肺癌(简称SCLC)的研究工作，发现CDKN2基因纯合性缺失和缺乏p16蛋白表达常见于NSCLC细胞系和原发性NSCLC，很少见于SCLC细胞系和原发性SCLC中^［8～11］。这些结果表明CDKN2基因的缺失和突变主要与NSCLC进展有关。Otterson等^［12］研究证实CDKN2表达缺乏存在于具有野生型Rb基因的NSCLC和极少数有野生型Rb基因的SCLC细胞，而48例Rb基因突变或表达缺乏的SCLC及7例NSCLC中6例均可检测到p16蛋白。在NSCLC和其细胞系中，CDKN2基因表达缺乏的频率因不同的研究，不同病期而不同，肺癌分期越高，CDKN2表达缺乏频率也越高。在NSCLC细胞系研究中，CDKN2改变的频率(缺失和突变)，从Kelley等^［11］研究的18/77(23%)到Okamoto等^［13］的14/21(71%)不等。对原发性NSCLC中CDKN2基因改变，观察到7%到21%NSCLC标本存在CDKN2缺失或突变^［14］，但在原发性NSCLC中CDKN2基因p16蛋白表达缺乏却高至51%至67%。Kratzke等进行的100例切除的NSCLC标本Rb和CDKN2基因表达研究中观察到p16蛋白表达缺乏与NSCLC患者生存期缩短相关。从上述研究结果可见CDKN2基因与肺癌密切相关。

三、CDKN2基因在NSCLC中的失活机制

许多研究表明在NSCLC中CDKN2基因的纯合性缺失或突变频率较高，但明显低于CDKN2基因p16蛋白表达缺乏频率，提示除了CDKN2基因纯合性缺失或突变外，p16蛋白缺乏或低水平还有其他的机制。

1.CDKN2基因纯合性缺失：如上所述大量的研究观察到在人类多种癌症细胞系和原发性肿瘤中存在高频率的CDKN2基因纯合性缺失。研究结果表明CDKN2基因纯合性缺失在NSCLC中是CDKN2失活的主要机制^［15］，明显不同于另一肿瘤抑制基因p53，其主要通过突变而失活。

2.CDKN2基因突变：尽管CDKN2基因的突变在大多数人类肿瘤中的发生频率明显低于CDKN2基因纯合性缺失，但无论在肿瘤来源的细胞系还是原发性肿瘤组织中均观察到不同频率的CDKN2基因内突变。有些肿瘤如食管鳞状细胞癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌等，还发现有较高频率的突变，甚至高达50%。Rusin、Makagawa、Shapiro等^{［14，16］}进行的NSCLC研究中，分别观察到71例NSCLC标本中有6例(8%)有突变，54例NSCLC标本中有4例(7%)存在点突变，以及54株细胞系中有6株(8%)有点突变，9例Rb阳性的NSCLC细胞系中有3例有点突变，包括C→T转换，致使产生半衰期缩短的p16蛋白，不能与CDK4/6形成复合物；G→T颠换，在内含子2拼接区，导致异常拼接或未拼接的mRNA，产生更小的p16蛋白，后者虽能与CDK4/6形成复合物，但由于半衰期缩短，p16蛋白不稳定，使游离CDK4/6增多；单个硷基插入的移码突变，导致不能检则到p16蛋白。由于在NSCLC中存在CDKN2基因内突变，包括无义突变、错义突变和移码突变，因此认为CDKN2基因突变是CDKN2失活的另一机制。

3.CDKN2基因甲基化

在CDKN2基因外显子1内CpG岛甲基化与NSCLC的CDKN2基因转录静止和p16蛋白表达缺乏密切相关。Otterson等检测了33株NSCLC细胞株，显示了CDKN2外显子1内富含G、C区域(CpG岛)的高甲基化存在于100%的未测到CDKN2突变且有野生型Rb表达的细胞株中，用去甲基化剂-5 aza2′deoxycytidine,可以诱导延迟的CDKN2基因表达p16蛋白^［12］。最近Shapiro等^［15］在9株Rb阳性的NSCLC细胞系CDKN2失活机制研究中，发现2株细胞系存在CDKN2基因外显子1内CpG岛的甲基化，在存在CpG岛甲基化的2株细胞中未检测到含外显子1编码真正p16蛋白的mRNA，致使转录静止，与Merlo等的CpG岛甲基化与肿瘤抑制基因CDKN2转录静止的观点一致。

四、CDKN2基因治疗应用前景

CDKN2基因已成为公认的肿瘤抑制基因，其编码的p16蛋白是CDK4抑制物，负调控细胞增殖。国外Jin等^［17］进行了腺病毒介导野生型CDKN2 cDNA质粒转染到CDKN2缺失的NSCLC细胞系，观察到细胞停滞在G1期，阻止细胞进入S期，而在有野生型CDKN2基因的乳腺癌细胞系中未观察到上述变化，并且在体内外实验中均观察到转染野生型CDKN2基因在NSCLC中表达能明显抑制细胞增殖及裸鼠成瘤率：Arap等应用磷酸钙沉淀法转染全长CDKN2 cDNA质粒到缺失CDKN2基因的人脑胶质瘤细胞系，同样观察到明显的细胞生长抑制^［17］。Shapiro等用逆转录病毒介导CDKN2基因到CDKN2基因阴性的NSCLC细胞系，导致克隆形成率减少，增加低磷酸化