关键词： 嗜肺军团菌；DNA探针；鉴定

【摘要】目的对嗜肺军团菌国外参考菌株及国内分离菌株的巨噬细胞感染增强子(mip)基因分析，建立一种快速、敏感、特异的嗜肺军团菌基因检测鉴定方法。方法利用嗜肺军团菌种特异性DNA片段mip基因通过聚合酶链反应(PCR)扩增,对PCR阳性产物进行地高辛标记的mip基因探针杂交,观察其反应结果。并对26株环境和患者中分离的疑似嗜肺军团菌菌株进行分析。结果所有实验用嗜肺军团菌国外参考菌株及国内分离菌株的mip基因的PCR扩增结果都为阳性，探针杂交结果也为阳性，而非嗜肺军团菌及与非军团菌对照菌株的PCR扩增结果及探针杂交结果都为阴性，本实验其灵敏度和特异度均为100％。另外26株疑似嗜肺军团菌菌株有6株被鉴定为嗜肺军团菌。结论所建立嗜肺军团菌的快速初步鉴定方法具有很高的特异性和敏感性，并具有较高的应用价值。

Polymerase chain reaction associated with dig-labelled DNA hybridization of mip gene to identify new isolated Legionella pneumophila strains

Lu Xihua, Peng Xiaomin, Ren Hongyu, et al. Institute of Epidemiology and Microbiology，Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 102206

【Abstract】ObjectveBy testing mip gene,one highly conservative virulence gene of Legionella pneumophila (Lp),as targets of polymerase chain reaction (PCR)and Digoxin-labelled probe hybridization to establish a rapid, specific and sensitive gene analysis method that can identify new isolated suspected bacteria strains as Lp.MethodAbstracting all the CDC reference Lp strains' and none-Lp Legionella strains′ DNA,as well as the domestic isolated Lp strains′ and some none-Legionella control bacteria's DNA as templates, then were processed. All the positive PCR products(if no PCR amplicons were available,the original whole DNA should be detected)were hybridized with Digoxingen-labelled mip gene probe in dot-blot procedure.ResultAll the tested Lp strains had positive PCR and hybridization results, at the same time,all none-Legionella bacteria and none-Lp Legionella strains got negative results. 6 of 26 isolates were identified as Lp strains by this method.ConclusionSuch a Lp strain identification procedure shows high specificity and sensitivity (nearly 100%, in this study),and meanwhile can be completed in a relative short time.Surly, this method can be largely available and has a potential value in diagnosis of clinical Legionellosis cases and pursuing the pathogen during Legionnaires' disease outbreaks.

【Key words】Legionella pneumophilaDNA hybridizationIdentification

军团菌是一种细胞内寄生的革兰阴性杆菌，为条件致病菌，在自然界的水和土壤中广泛存在。军团菌一般以气溶胶的方式在空气中传播，一旦进入人体呼吸系统，部分直径在2～5μm左右的含菌微粒可以到达下呼吸道的细支气管和肺泡内引发感染，导致军团病。可以在自然水环境及人工水环境，如河水、湖水、池塘水以及自来水系统、空调系统冷却塔水、淋浴用水等中分离到该菌，也可从患者的痰液、胸液、支气管灌洗液、血液中分离出军团菌。军团病因其临床症状不典型，常致漏诊、误诊，使该病的病死率较高。嗜肺军团菌(Lp)是引起军团病的优势种，其所导致的军团病病例占总军团病病例的80％以上。多数军团病的爆发流行也是由嗜肺军团菌所引起。我们利用嗜肺军团菌种特有的巨噬细胞感染增强子(mip)基因片段, 通过聚合酶链反应(PCR)扩增、地高辛标记的mip基因探针杂交，试图建立嗜肺军团菌快速初步鉴定方法，并用该方法对新分离的26株疑似嗜肺军团菌进行了鉴定。

材料与方法

1、菌株来源：(1)参考菌株和对照菌株：参考菌株嗜肺军团菌（Lp）及非嗜肺军团菌博茨曼军团菌(Lb), 杜莫夫军团菌(Ld), 高曼军团菌(Lg), 佐丹军团菌(Lj), 长滩军团菌(Ll), 米克戴德军团菌(Lm)均由美国CDC赠送；对照菌株除来自本所各研究室外，部分购自卫生部药品生物制品检定所。(2)国内分离菌株：实验所用国内嗜肺军团菌菌株均由本室分离保存。(3)待鉴定菌株：待鉴定26株疑似嗜肺军团菌来自北京市卫生防疫站，为环境和患者分离株。

2.细菌培养：(1)军团菌的培养：军团菌及疑似嗜肺军团菌菌株均经军团菌特殊培养基BCYE培基培养，35℃烛缸培养48小时收获。(2)非军团菌的培养：实验用对照菌株分别按不同的培养要求进行培养，收获。

3.细菌DNA提取：细菌DNA的提取，参照文献^［1］进行。

4.PCR扩增：(1)引物设计：参照文献报道的嗜肺军团菌mip基因序列^［2］设计引物，上下游引物之间包含了mip基因1kb左右大小的DNA片段。(2)扩增程序：50μl反应体系中包括引物2μl（上下游引物各1μl，2.5μ mol/L），4μl dNTPs（每一种各1μl，10mmol/L），2μl DNA模板和3U Taq酶。94℃ 变性1分钟，54℃复性1分钟,72℃延伸1分钟，共30循环。详细程序参考文献^［3］。

5.mip基因片段探针的制备：利用原序列测定菌株Lp. Philadephia-1（嗜肺军团菌费城-1株）的mip基因PCR扩增产物，经透析袋电泳洗脱法^［4］纯化回收,作为随机引物法探针制备的模板，具体步骤参照地高辛试剂盒生产厂家（宝灵曼公司，德国）提供的说明书。采用反向杂交法^［5］测定所制备探针的敏感性。

6.mip基因探针杂交：预杂交、杂交的温度均为70℃，洗膜温度为68℃。杂交Tm值按公式Tm=(G+C)%×0.41+69.3 计算。采用抽滤加样器(Dot filtration Manifold)将变性后的被检DNA转移至硝酸纤维膜上，以斑点印迹(Dot blot)进行检测。实验方法及步骤参照文献^［5］及厂家说明书。

结果

一、参考菌株、国内分离菌株及对照菌株的mip基因PCR扩增及DNA杂交结果

经多次实验，嗜肺军团菌1～14血清型参考菌株和国内分离的15株嗜肺军团菌菌株（B1、B2、J1、J2、J3、124－5、302－5、80-82、89-2、JSH7、 FSH、YYZH、SHY-2、SHY-3、SHY-4）的PCR扩增结果均为阳性，都能扩增出 1kb大小的DNA片段，而非嗜肺军团菌参考菌株Lb、Ld、Lg、Lj、Ll、Lm及对照菌株金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、枸橼酸盐杆菌、乙型溶血性链球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎双球菌、流脑奈瑟菌、霍乱弧菌、鼠伤寒沙门菌、钩端螺旋体、痢疾杆菌、鼠疫杆菌、布鲁杆菌及小肠结肠炎耶尔森菌的扩增结果均为阴性。可见，其特异性很高，并具有很好的稳定性。对各PCR产物进行的斑点印迹地高辛标记探针杂交，结果都为阳性。而非嗜肺军团菌和对照菌株以全DNA为杂交的靶基因（因无特异PCR产物）杂交结果皆为阴性。因此本组实验中，认为以mip基因为探针杂交目标时，其特异度和灵敏度均为100％。

二、待鉴定菌株mip基因PCR扩增及DNA探针杂交结果

1. mip基因PCR扩增结果：6株待鉴定菌株的mip基因片段PCR扩增结果见图1。

2.6株待鉴定菌株的mip基因DNA杂交结果：6株待鉴定菌株mip基因PCR扩增产物的DNA杂交结果见图2。

M.Marker；λ DNA/HindⅢ +EcoRI；

1.BF34；2.BF35；3.BF41；4.BF47；5.BF51；

6.BF52；7.阴性对照；8.阳性对照

图16株待鉴定菌株的mip基因片段PCR扩增结果

1.BF34；2.BF35；3.BF41；4.BF47；5.BF51；

6.BF52；7.阴性对照；8.阳性对照

图26株待鉴定菌株mip基因PCR扩增产物的DNA杂交结果

讨论

基因分析方法已广泛应用于细菌的分型和鉴定之中，如PCR、DNA/RNA探针杂交、细菌全DNA 酶切图谱、鸟嘌呤、胞嘧啶(GC)含量测定，DNA/RNA同源性分析等。细菌的基因型相对而言更具特异性，从基因水平对细菌进行分析已成为细菌鉴定必不可少的组成成分。目前已报道军团菌属共有39种61个血清型^［6］。DNA杂交技术已作为军团菌鉴定、分类的常用方法^［7］。mip基因的表达产物Mip蛋白是迄今所公认的嗜肺军团菌毒力因子之一，为嗜肺军团菌种所特有^［8］。研究表明军团菌的其它种内虽然也存在与mip蛋白功能类似的蛋白，但相应基因（即mip样基因）与mip基因核苷酸序列的同源性仅在30%～71％左右。本组实验应用嗜肺军团菌种特异性基因片段mip基因作为DNA杂交的目标基因来对疑似嗜肺军团菌进行鉴定，其成功的根据在于所制备<