【摘要】目的观察腺相关病毒和人γ-干扰素的重组体pWIG转染淋巴细胞及在细胞内表达情况。方法将pWIG以DNA-磷酸钙共沉淀法转染人淋巴细胞株H9，再分别用聚合酶链反应(PCR)、逆转录-PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法在DNA、RNA和蛋白质水平研究该重组体导入细胞和在细胞内表达的情况。结果转染pWIG的H9细胞的DNA和RNA经PCR和RT-PCR检测均有504 bp的DNA条带；用ELISA可测出γ-干扰素的表达量为17.2 pg/3×10⁶细胞。结论重组体pWIG用DNA-磷酸钙共沉淀法导入细胞后，转录HuIFN-γ mRNA，并翻译人γ-干扰素蛋白。为基因治疗的进一步研究打下基础。

Transfection and expression of the recombinant adeno-associated virus carrying human interferon-γ in human lymphocyte

ZHU Haihong, CHEN Zhi, ZHANG Mingtai, et al.

（Institute of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital,Medical college of Zhejiang University,Hangzhou 310003, China）

【Abstract】ObjectiveIn order to study the transfection and expression of the recombinant pWIG of Adeno-associated virus and Human interferon-γ(HuIFN-γ) in human lymphocyte.MethodsAfter transfecting pWIG into human lymphocyte via calcium phosphate, DNA, RNA and protein extracted from transfected cells were detected by polymerase chain reaction(PCR), reverse transcription PCR(RT-PCR) and ELISA. ResultsThe 504 bp bands were detected from PCR and RT-PCR products of the DNA and RNA from the cells transfected, and HuIFN-γ protein were detected to be 17.2 pg/3×10⁶ cells by ELISA.ConclusionThe recombinant pWIG could produce HuIFN-γ mRNA after the transfection via calcium phosphate, and translate corresponding protein further. This lays ground for the further research of gene therapy.

【Key words】Gene therapy; Interferon γ; Adeno-associated virus; Lymphocyte

腺相关病毒(AAV)是目前基因治疗的常用载体系统之一。因其具有稳定表达、定点整合、安全性较高等优点而受到重视。我们在以往工作的基础上^［1］，将已构建成功的腺相关病毒和人γ-干扰素(HuIFN-γ)基因的重组体pWIG转染源于人淋巴细胞的H9细胞株，在DNA、RNA、及蛋白水平探讨其表达状态。

材料和方法

一、材料

(一)DNA质粒和细胞株pwp19载体由美国阿肯萨斯大学提供，为带有腺相关病毒末端反向重复序列的真核表达载体，详细资料参见文献［2］。重组体pWIG为本研究小组构建，是腺相关病毒载体pwp19和包含信号肽的HuIFN-γ的编码区cDNA的重组体。pGEM-1-IFN-γ质粒内带有人IFN-γ cDNA全基因，由军事医学科学院提供。H9细胞株：是本所长期保存的传代细胞株，为有缺陷的CD4⁺ T淋巴细胞株。

(二)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和PCR试剂M-MLV逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs混合液等均购自美国Gibco BRL公司。Hu-IFN-γ引物是根据Devos等^［3］的报道合成，其扩增产物为含信号肽的504 bp HuIFN-γ编码区cDNA，由美国Gibco BRL公司合成。上游引物：5′-GCATGAAATATACAAGTTATATCTTGG-3′，下游引物：5′-ATTTACTGGGATGCTCTTCGACC-TC-3′。Oligo(dT)₁₅：购自美国Promega公司。

(三)HuIFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂购自晶美生物工程公司(美国Genzyme公司进口分装)。

(四)培养基试剂RPMI 1640和Hepes粉剂购自美国Gibco BRL公司；超级小牛血清购自浙江杭州四季青生物制品研究所，按说明书配制。

(五)其他试剂Trizol Reagent购自美国Gibco BRL公司；DNA酶Ⅰ(RNase-free)购自德国宝灵曼公司。

二、方法

(一)重组体转染H9细胞用DNA-磷酸钙共沉淀法。首先将大量扩增后的重组体pWIG制成DNA-磷酸钙悬液，静置0.5 h后重悬3×10⁶个H9细胞，置于CO₂培养箱内0.5 h后加入含10%小牛血清的1×RPMI 1640，参照文献［4］进行。12 h后更换培养液，60 h后收获细胞。

(二)3组对照细胞的设立1.转染pwp19的细胞；2.经磷酸钙悬液处理的细胞(不含质粒DNA)；3.未处理细胞。

(三)细胞收获保留细胞培养上清。用生理盐水洗涤细胞4次后收集细胞，并保留最后1次的细胞洗涤液。同时以Trizol连续抽提实验组和对照组细胞内总RNA、DNA和蛋白质，按照产品说明书进行操作。

(四)PCR检测重组体导入细胞内情况实验组和对照组细胞内抽提出的DNA以及细胞洗涤液直接用HuIFN-γ引物作PCR。程序为：94℃变性1 min,55℃退火40 s，72℃延伸40 s，三步为一个循环，共35个循环，最后72℃延伸18 min。具体操作参照文献［4］。

(五)RT-PCR检测重组体在细胞内mRNA的表达情况实验组和对照组细胞内抽提出的总RNA经DNase Ⅰ消化后，以Oligo(dT)₁₅作为逆转录反应的引物，37℃水浴1 h后以HuIFN-γ引物作PCR，反应程序同前。具体操作参照文献［4］。

(六)ELISA检测细胞内HuIFN-γ蛋白的表达情况实验组和对照组细胞的培养上清和细胞内抽提的蛋白质，按检测试剂盒说明书进行检测。

结果

一、PCR检测重组体导入细胞内情况

经pWIG转染的细胞DNA扩增出504 bp条带，三组对照细胞的DNA和细胞洗涤液均未扩增出504 bp条带，见图1。说明pWIG已成功导入H9细胞内。

1.pGEM-1-IFN-γ的PCR产物(504 bp)；

2.100 bp ladder(Promega公司)；

3.洗涤细胞的0.9% NaCl的PCR产物；

4.转染pWIG细胞的DNA的PCR产物(504 bp)；

5.转染pwp19细胞的DNA的PCR产物；

6.磷酸钙处理细胞的DNA的PCR产物；

7.未处理细胞的DNA的PCR产物

1细胞内抽提DNA的PCR结果

1.转染pwp19细胞总RNA的RT-PCR产物；

2.磷酸钙处理细胞总RNA的RT-PCR产物；

3.未处理细胞总RNA的RT-PCR产物；

4.水作空白对照；

5.转染pWIG细胞总RNA的RT-PCR产物(504 bp)；

6.pGEM-1-IFN-γ的PCR产物(504 bp)；

7.100 bp ladder(Promega公司)

2细胞内抽提总RNA的RT-PCR结果

二、RT-PCR检测重组体在细胞内的mRNA表达情况

经pWIG转染的细胞总RNA以Oligo(dT)₁₅作引物进行逆转录扩增出504 bp条带，3组对照细胞的总RNA均未扩增出任何条带，见图2。提示pWIG在细胞内已成功表达出HuIFN-γ mRNA，且其3′末端带有polyA。

三、ELISA检测细胞内HuIFN-γ蛋白的表达情况

转染pWIG的细胞：3×10⁶细胞抽提出的蛋白中检测出17.2 pg HuIFN-γ蛋白，培养上清中未测到HuIFN-γ蛋白。

3组对照细胞：培养上清和细胞内抽提的蛋白中均未检测到HuIFN-γ蛋白。提示转染pWIG的细胞有HuIFN-γ蛋白表达，而对照组细胞则未检测到。

讨论

目的基因和靶细胞的选择和获得以及基因转移方式的选择均是基因治疗的重要问题。以病毒载体介导为主的生物学方法是目前常用的基因转移方式之一。在各种病毒载体系统中AAV载体系统因安全性相对较高^［5］、潜伏感染人体时可以特异地整合到宿主细胞的19号染色体上^［6］、外源基因可以长期稳定表达^［7］、分裂期细胞和静止期细胞均能被感染等优点^［8］引起人们的重视。γ-干扰素作为一种重要的细胞因子，具有较高的抗肿瘤和抗肝纤维化活性，已在临床广泛应用。肝脏疾病基因治疗的靶细胞，常选择外周血淋巴细胞(PBL)、肝癌组织中的肿瘤浸润性淋巴细胞、肝细胞及肝癌细胞等。其中外周血淋巴细胞易从体内取出、分离；回输方便；体外在白细胞介素-2刺激下可进行培养和扩增；可有效地被外源基因转导，并可耐受筛选过程的操作；回输人体后，能继续存活且具有生物学功能^［9］。因此本研究采用PBL作为靶细胞。

利用基因治疗的方法在真核细胞内表达的γ-干扰素，其空间结构比重组蛋白更接近天然干扰素，且具有局部浓度高、分泌到细胞外可发挥旁分