【摘要】目的研究伤寒杆菌DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)变异与其耐喹诺酮类的关系。方法应用聚合酶链反应(PCR)检测、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)及序列测定，对伤寒杆菌S275(临床分离敏感菌株)及其自发耐药突变株RG₁，DNA gyrA喹诺酮类耐药决定区进行了研究。结果伤寒杆菌S275 gyrA第128～426位碱基与大肠杆菌KL-16高度同源，仅7.49%有差异，且大部分为静变异，最终仅使DNA旋转酶A亚单位产生Thr-45→His、Arg-49→Leu及Val-56→Gly，均位于喹诺酮耐药决定区(第67～106位氨基酸)外。RG₁仅有第247位碱基T→G变异，相应Ser-83→Ala，使萘啶酸、氧氟沙星及环丙沙星对伤寒杆菌的MIC由2、0.06、＜0.03 mg/L上升为512、2、1 mg/L。Ala替换与文献报道沙门杆菌该位以苯丙氨酸、酪氨酸替换为主不同。PCR-RFLP及SSCP分析结果与上述情况类似。结论gryA第83位变异为其耐药主要原因。

A study on the molecular basis of quinolone resistance mechanism in salmonella typhi

XIAO Yonghong, WANG Qinan.

（The First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China）

【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between the gene mutations of DNA gyrase subunit A (gyrA) and quinolone resistance in Salmonella typhi.MethodsThe genes of gyrA DNA of Salmonella typhi S275 (a clinically isolated quinolone susceptible strain) and its spontaneous quinolone-resistant mutant RG₁ were examined in this study with polymerase chain reaction (PCR), restrictive fragments length polymorphism (RFLP), single strand conformational polymorphism (SSCP) and nucleotide sequencing. ResultsNudeotide sequencing of gyrA in Salmonella typhi S275 revealed that the bases of 128～426 kept highly conservative as compared with those of Escherichia coli KL-16, with only 7.49% difference in the gyrA nucleotides 128～426 between the two strains. Most of the mutations were silent mutations,which contributed to 3 amino acid substitutions in gyrase (including Thr-45→His,Arg-49→Leu and Val-56→Gly), and all these substitutions were located outside the quinolone resistance determining region (amino acids 67-106 of subunit A of gyrase). In comparison with Salmonella typhi S275, a single mutation was found at base 247 of gyrA of Salmonella typhi RG₁, with change transferred from T to G and led to a substitution of Ser-83→Ala. The mutation might be responsible for the increase of MICs of nalidixic acid, ofloxacin and ciprofloxacin against Salmonella typhi from 2,0.06 and ＜0.03 to 512, 2, and 1 mg/L respectively. Ser-83→Ala was also a newly discovered substitution in gyrA of Salmonella spp. The results of PCR-RFLP and SSCP were in concordance with results of nucleotide sequencing.ConclusionsThe mutation of gyrase at the 83rd amino acid maybe play a principal role in the resistance of Salmonella typhi to quinolone.

【Key words】Salmonella typhi; gyrA; Polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism; Single strand conformational polymaphism; DNA Sequence

伤寒作为我国常见传染病，氟喹诺酮类作为主要治疗药物已受到广泛认可。近年来耐氟喹诺酮类伤寒杆菌已有报道^［1］，我们在实验室利用平板法，从临床分离喹诺酮敏感伤寒杆菌S275筛选出两代耐药菌RG₁、RG₂，经研究证明，RG₁耐药以DNA旋转酶变异与药物主动外流为主，RG₂则在RG₁基础上有外膜蛋白改变，表明细菌耐喹诺酮类多种机制均可在伤寒杆菌发生。

我们利用分子生物学技术对RG₁ DNA旋转酶A(gyrA)与拓扑异构酶IV parC基因喹诺酮类耐药决定区进行了更深入的分子生物学调查，结果如下。

材料与方法

一、菌株

伤寒杆菌S275为我院1996年临床患者血培养分离所得对喹诺酮类敏感的菌株，用平板法筛选其耐药变异株RG₁。挑取单个伤寒杆菌S275菌落接种于10 ml Mueller-Hinton肉汤(MHB，1 000 ml含牛肉浸膏5 g，水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g)，过夜培养后，以少许菌液均匀涂布于含4 μg/ml(2×MIC)萘啶酸的Mueller-Hinton琼脂(MHA)，37°C温育48 h后，得耐药变异株RG₁，与S275共同用于下列研究。

二、抗菌药物及主要试剂

氧氟沙星(OFLX)由日本第一制药株式会社提供，环丙沙星(CPFX)为太原制药厂提供，萘啶酸(NA)购自Sigma公司。

扩增DNA gyrA上游引物为：5′-TGTCCGAGATGGCCTGAAGC-3′，位于大肠杆菌gyrA 108～127位碱基；下游引物为5′-TGCCGTCATAGTTATCAACG-3′与大肠杆菌gyrA 435～454位碱基互补。拓扑异构酶IV亚单位C基因(parC)上游引物为5′-GTATGCGATGTCTGAACTGG-3′，位于大肠杆菌parC基因第72～92位碱基；下游引物5′-GTGGTGCCGTTAAGCAAA-3′与大肠杆菌parC基因第427～444位碱基互补。上述引物均委托中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。合成仪为Beckman Oligo 1000型。dNTP、Taq酶、限制性内切酶Hinf Ⅰ、Wizard聚合酶链反应(PCR)产物纯化试剂盒、DNA银染试剂盒均购自Promega公司；DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。

三、药敏试验

以试管双倍稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。过夜生长的细菌，以生理盐水稀释为0.5麦氏单位，加入到倍比稀释抗生素的系列MHB中，使最终接种量为10⁴～10⁵CFU/ml，37°C温育18 h后观察结果，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。

四、PCR扩增gyrA与parC

按参考文献［2］方法。1 ml过夜培养伤寒杆菌10 000×g，5 min收集沉淀，加入600 μl TE缓冲液(pH8.0)混悬，加入10%十二烷基硫酸钠(SDS) 30 μl， 37°C温育1 h后，用等量酚、酚氯仿、氯仿抽提后作模板DNA。50 μl反应混合物含10 mmol Tris HCl (pH 9.0)、50 mmol KCl、0.1% Triton X-100、1.5 mmol MgCl₂、0.2 mmol dNTP、1U Taq酶、上下游引物各50 pmol、DNA模板2 μl。初始循环94°C、1.5 min,60°C、2 min,72°C、3 min；后续94°C、1 min,60°C、1 min,72°C、3 min，30循环；最后72°C延伸15 min。产物以2%琼脂糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸分子量标准为pBR 322/Hinf Ⅰ片段。

五、gyrA PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及单链构象多态性(SSCP)分析^［3］

RFLP分析反应混合物(20 μl)含2.5 mmol Tris醋酸(pH7.8), 10 mmol醋酸钾、1 mmol醋酸镁、0.1 mmol二硫苏糖醇、Hinf Ⅰ 5U及PCR扩增产物5 μl 37°C温育4 h后，3%琼脂糖电泳，0.5 μg/ml溴化乙锭染色，紫外光下观察结果。核酸分子量标准为pBR322/Bst NI片段。

SSCP分析用PCR产物5 μl，加DNA变性液(含95%甲酰胺、20 mmol依地酸(EDTA)、0.03%二甲苯蓝FF，及0.05%溴酚蓝)5 μl，80°C变性5 min后置冰浴，再于8%聚丙烯酰胺凝胶，15°C电泳。用银染试剂盒，按产品指南行银染色，观察结果。

六、PCR产物测序

利用PCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA、parC PCR产物，纯化产物以前述引物为引物，用末端标记测序试剂盒，在Perkin-Elmer ABI 310型自动测序仪测序。

结果

一、药敏试验

NA、OFLX、CPFX对S275与RG₁的MIC值分别为2、0.06、＜0.03与512、2、1 mg/L。

二、gryA与parC PCR扩增结果

gyrA为347 bp DNA片段，parC为372 bpDNA片段。

三、gryA PCR-RFLP与SSCP结果

Hinf Ⅰ酶切伤寒杆菌S275 gyrA为138、110、99 bp三个片段，RG₁仅有237、110 bp二个片段。伤寒杆菌S275 gyrA SSCP分析可见两条核酸带，而RG₁仅有一条核酸带。示RG₁ gyrA有碱基变异。

四、DNA测序结果及推定氨基酸序列

见图1。伤寒杆菌S275 gyrA序列与大肠杆菌KL-16高度同源，仅有23个碱基差异，占7.49%。伤寒杆菌RG₁仅于247位由T变异为G。图2示伤寒杆菌gyrA推定氨基酸序列，与大肠杆菌KL-16比较仅有3个氨基酸差异，第45、49、56位氨基酸分别为Thr→His、Arg→Leu、Val→Gly变异，伤寒杆菌RG₁第83位氨基酸为Ser→Ala变异^［4］。

伤寒杆菌S275与RG₁ parC序列两者相同。

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