【摘要】目的探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ, HRP Ⅱ)基因在真核细胞中的表达。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增HRP Ⅱ全编码区基因，经HindⅢ和Bam HI双酶切后定向克隆入带CMV启动子的真核高效表达载体pcDNA3，构建HRP Ⅱ/pcDNA3重组载体；用脂质体法将重组载体转染HepG2肝癌细胞，经G418加压筛选后，收集阳性克隆细胞培养上清，表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果成功构建HRP Ⅱ/pcDNA3真核表达载体，SDS-PAGE和Western免疫印迹分析表明，HRP Ⅱ表达产物相对分子质量约35 000，呈分泌性表达，且表达产物能被抗HRP Ⅱ单克隆抗体特异识别。结论恶性疟原虫HRP Ⅱ全编码区基因在肝癌细胞HepG2中获得成功表达。

Cloning and expression of histidine-rich protein Ⅱ gene of Plasmodium falciparum

FANG Jianmin, YU Xinbing, LUO Shuhong, et al.

（Department of Parasitology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China）

【Abstract】ObjectivePlasmodium falciparum synthesizes and secretes histidine-rich proteins Ⅱ (HRP Ⅱ) into plasma during asexual blood stage of life cycle. HRP Ⅱ is an ideal diagnostic antigen for falciparum malaria. In this report, our purpose was to investigate gene expression of HRP Ⅱ in eukaryotic cells.MethodsThe entire coding region of HRP Ⅱ gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR). PCR products were cut by Hind Ⅲ and Bam HI, and inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3. Recombinant vectors were transfected HepG2 cells by means of liposome. Positive clones were cultured and screened under the high level of G418. The supernatants of these clones were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blotting assay. ResultsHRP Ⅱ gene was successfully cloned into pcDNA3 vector. The results of SDS-PAGE and Western blotting assay showed:(1) the molecular weight of the expressed products was about 35 000, (2) HRP Ⅱ was secreted into culture supernatant by the signal peptide, (3) the expressed products could specifically bind with anti-HRP Ⅱ McAbs.ConclusionThe findings suggested that HRP Ⅱ gene of Plasmodium falciparum had been successfully expressed in pcDNA3/HepG2 eukaryotic system.

【Key words】Plasmodium falciparum; Histidine-rich protein Ⅱ; Gene expression

富组蛋白Ⅱ(HRP Ⅱ)是恶性疟原虫无性期合成并分泌至红细胞外的一种水溶性糖蛋白^［1］，它富含组氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，并存在丙氨酸-组氨酸-组氨酸(AHH)和丙氨酸-组胺酸-组氨酸-丙氨酸-组胺酸-天冬氨酸(AHHAAD)串接重复序列^［2，3］。实验表明，早在环状体开始发育后2～8 h内，即可探测到体外同步培养虫体的培养上清中HRP Ⅱ抗原，并随着红内期发育的不断进行，尤其是当裂殖体破裂时^［1］，所释放的量呈不断增长趋势。因此，以HRP Ⅱ循环抗原作为靶分子，用来检测恶性疟原虫感染是理想方法^［4］。我们在以往研究基础上，通过克隆HRP Ⅱ全编码区基因，探讨其在真核细胞中的表达，并对表达产物的生物学活性进行分析。

材料和方法

一、材料

(一) 虫株、载体与菌株恶性疟原虫(FCC1/HN株)、大肠杆菌TG1和肝癌细胞HepG2为本室保种，pcDNA3为InVitrogen公司产品。

(二) 主要试剂Taq DNA聚合酶、T₄DNA连接酶、Hind Ⅲ和Bam HI购自Promega公司；抗HRP Ⅱ人工合成九肽(AHHAHHAAD)单克隆抗体为中国预防医学科学院寄生虫病研究所惠赠；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为华美生物工程公司产品；Lipofectin为Gibco BRL公司产品；丙烯酰胺、N，N′-亚甲双丙烯酰胺和TEMED均为Merck公司产品，其它均为国产分析纯级试剂。

(三) 培养基胰蛋白胨、酵母抽提物为OXOID公司产品，RPMI 1640为Gibco BRL公司产品，HEPES为ALDRICH公司产品，G418为Boehringer Mannheim公司产品，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。

二、方法

(一) HRP Ⅱ全编码区基因的扩增根据HRP Ⅱ完整基因序列^［2，5］，在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(P₁ 5′-GGCAAGCTTATGGTTTCCTTCTCAAAA-3′和P₂ 5′-GCGGGATCCTTAATGGCGTAGGCAATG-3′)，并在两端分别引入Hind Ⅲ和Bam HI切点。引物由上海生工生物工程有限公司合成，使用前经15%的PAGE纯化。在0.5 ml Eppendorf管中依次加入：32.75 μl双蒸水、5 μl 10×Buffer、5 μl 2 mmol/L dNTP、1 μl 25 μmol/L P₁、1 μl 25 μ mol/L P₂、2 μl恶性疟原虫基因组DNA和3 μl 25 mmol/L MgCl₂,混匀。95°C预变性5 min，加入0.25 μl Taq DNA聚合酶(5 U/μl)，石蜡油覆盖液面。扩增条件：94°C变性40 s、63°C退火40 s，72°C延伸60 s，循环30次后，72°C保温7 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。

(二) HRP Ⅱ/pcDNA3重组载体的构建与鉴定将酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后的上述聚合酶链反应(PCR)产物和pcDNA3空质粒分别用Hind Ⅲ和Bam HI双酶切1 h，再经二乙氨乙基(DEAE)膜(Schleicher & Schuell公司产品)电泳回收。酶切PCR产物与载体按5∶1摩尔数比混合，在16°C条件下用T₄ DNA连接酶连接过夜，随后转化氯化钙法制备的大肠杆菌TG1感受态细胞。随机挑取含氨苄西林转化平板上生长菌落，碱裂解法抽提其质粒DNA，进行双酶切和PCR鉴定。

(三) HRP Ⅱ/pcDNA3转染HepG2细胞脂质体法，按产品说明书进行。采用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养，G418进行加压筛选、传代培养。收集阳性克隆细胞培养上清，并用葡聚糖凝胶(Dextran Gel 25)进行浓缩^［6］。

(四) 表达产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹分析均按常规方法进行^［7］。

结果

一、HRP Ⅱ全编码区基因的扩增和HRP Ⅱ/pcDNA3重组质粒的构建

利用自行设计的引物P₁和P₂，成功扩增出HRP Ⅱ全编码区基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约1.0 kb，与预期片段大小相符合，且无非特异扩增现象(图1)。从氨苄西林LB琼脂平板上随机挑取菌落，碱裂解法抽提其质粒DNA，Hind Ⅲ和Bam HI双酶切均切出1.0 kb和5.4 kb二个片段，前者为HRP Ⅱ外源基因，后者为pcDNA3载体，用PCR方法也扩增出1.0 kb同样大小的片段(图1)。由此表明，HRP Ⅱ全编码区基因已按正确方向克隆入真核载体pc-DNA3,HRP II/pcDNA3重组质粒构建成功。

1.λDNA/Hind Ⅲ标准分子量；2.pcDNA3经Hind Ⅲ/Bam HI双酶切；3.HRP Ⅱ/pcDNA3经Hind Ⅲ酶切；4.HRP Ⅱ/pcDNA3经Bam HI酶切；5.HRP Ⅱ/pcDNA3经Hind Ⅲ/Bam HI酶切；6.HRP Ⅱ/pcDNA3的PCR扩增；7.恶性疟原虫(FCC1/NH株)基因组PCR扩增；8.PCR标准分子量

1HRP Ⅱ全编码区基因扩增和重组子鉴定

(1%琼脂糖凝胶电泳)

二、HRP Ⅱ/pcDNA3转染HepG2细胞

用脂质体法将重组质粒转染HepG2细胞，在G418加压选择培养下，从第4周开始形成细胞克隆，随机选择细胞集落进行克隆化培养，用高浓度G418加压筛选，并不断传代培养，结果从中筛选获得K₁、K₂和K₃等克隆细胞株。

三、表达产物的生物活性鉴定

收集K₁、K₂和K₃等克隆细胞的培养上清，经葡聚糖凝胶浓缩后，进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，进一步Western印迹分析表明，其中K₁和K₂克隆细胞株约在相对分子质量35 000处分别有一特异反应条带(图3)，与HRP Ⅱ的分子量理论计算值相一致，说明HRP Ⅱ基因在HepG2细胞中呈分泌性表达，且表达产物能被抗HRP Ⅱ人工合成九肽单克隆抗体特异识别，而K₃、单纯HepG2细胞和pcDNA3空载质粒转化细胞的培养上清均无特异显色条带，说明K₁和K₂克隆细胞株中HRP Ⅱ基因获得成功表达。

1.HepG2细胞；2.pcDNA3转染HepG2细胞；3.K₁细胞；4.K₂细胞；5.K₃细胞；6.低分子量蛋白标准物

2不同细胞培养上清的SDS-PAGE分析

猜你喜欢

• 针刺研究在美获肯定——美国NIH召开针刺疗法听证会

  2022-07-30

• 第18届国际生物化学与分子生物学学术会议将于英国伯明翰

  2022-07-30

• 中华医学会产生新一届理事会，吴阶平任名誉会长，张文康

  2022-07-30

• 一九九九年第十一届全国爱牙日主题及口号

  2022-07-30

• ’99世界养生大会信息

  2022-07-30

• 中国红十字会全国会员代表大会闭幕

  2022-07-30