【摘要】目的研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBV X蛋白)能否结合共同转录因子ⅡB(TFⅡB)。方法应用体外蛋白与蛋白结合试验(Pull-Down试验)和Far-Western Blot试验，以及细胞内联合免疫沉淀试验。结果HBV X蛋白能直接与普通TFⅡB结合。HBV X的X199(51-99)是结合TFⅡB的最小基团。研究还证实土拨鼠肝炎病毒X蛋白(WHX)同样能与TFⅡB结合。细胞内联合免疫沉淀试验更进一步证实了体外蛋白与蛋白结合实验的结果。结论嗜肝DNA病毒X蛋白与TFⅡB结合是其发挥反式转录激活作用的机制之一。

Study on the binding of HBV X protien to the general transcription factor ⅡB

YANG Yida, MA Yilin, ZHEN Lin, et al.

Department of Infectours Diseases, The First Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310003

【Abstract】ObjectiveTo study the binding of HBV X protein(HBV X) to the general transcription factor ⅡB(TF ⅡB).MethodsPull-Down assay in vitro, Far-Western Blot assay and Co-Immunopreci-pitation assay in vivo were used to detect the binding of HBX protien to TF ⅡB.ResultsIt was found that HBX binded TF ⅡB directly and HBV X 199(51-99)is the minimal domain responsible for the binding to TF ⅡB. Furthermore, the binding of TF ⅡB-HBX in vitro was confirmed by intracellular co-immunoprecripition assay. It was also found that the woodchuck hepatitis virus X protien (WHX) was to bind TF ⅡB.ConclusionThese RE results suggest that the interaction between HBX and TF ⅡB maybe of the mechanisms which account for its transcription activity.

【Key words】Hepatitis B virus X proteinGeneral transcription factor ⅡBBinding

乙型肝炎病毒(HBV)X基因编码相对分子质量为17 000的X蛋白(HBV X蛋白)，具有反式转录激活作用，能广泛激活病毒和细胞的启动子的转录，在HBV复制，感染以及慢性HBV感染所致肝细胞癌(HCC)中均有十分重要的作用^［1］。已报道的HBX结合蛋白有RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)亚单位RPB5、TATA反应元件结合蛋白(TBP)及共同转录因子TFⅡB^［2，3］等。HBX是通过与这些因子以及许多未知的蛋白结合参与了转录的调节。共同转录因子ⅡB(TF ⅡB)是RNA PolⅡ转录起始复合物(PIC)中的重要成分，它与TBP结合组成了PIC最基本结构；而且RNA PolⅡ与TFⅡB结合后才能进入PIC发挥其功能；同时TFⅡB又是许多具有转录活性的病毒蛋白如单疱疹病毒的VP16、EB病毒的EBNA-2、猴病毒的大T抗原等结合的靶蛋白^［4］，在转录调节中有重要作用。我们用不同的方法证实HBV的HBV X蛋白也能结合TFⅡB，现将结果报道如下。

材料与方法

(一) 质粒构建

大肠杆菌表达质粒pGENK1购自Stragagene公司，表达谷胱苷肽S转移酶(GST)融合蛋白。本实验所有的GST融合蛋白中含有能被cAMP依赖蛋白激酶磷酸化部位。HBV X蛋白全长和截短(Truncated)突变体X-1、D1、D3、D5、X16、X199和GST-WHX融合蛋白表达质粒由日本金泽大学村上教授提供。TFⅡB cDNA亦由村上教授赠送。全长TFⅡB cDNA被插入pGENK1作为大肠杆菌(E.coli)蛋白表达质粒。构建方法以约0.5μgTFⅡB片段和1μg pGENK1载体(Vector),加入1.5μl Ligation High(Takara)在室温下放置2小时。将连接好的质粒在冰上放置1小时，同时从-80°C冰箱中取出感受态细胞E.coli.XL-1 Blue(Stratagene)置于冰上融化，40μl感受态细胞加于连接后的质粒中，再在冰上放置30分钟，然后置37°C水浴箱中2分钟，再快速置于冰上2分钟，加入0.5ml SOC培养基，37°C震荡温育30分钟，离心收集细胞，接种于含氨苄青霉素(Amp)的LB培养皿中，37°C温箱过夜培养。以5GST为正链引物，GSTR为负链引物，聚合酶链反应(PCR)法筛选出阳性克隆。

哺乳动物细胞表达质粒NKFlag Vector由日本金泽大学肿瘤所山下博士提供，该质粒含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，全长HBV X蛋白片段(insert)以酶切方法取自pGENK1 HBV X蛋白-1，将0.5μg HBV X蛋白片段，1μg NKFlag Vector,1.5μl Ligation High共同在室温下温育2小时，转化至XL-1 Blue感受态细胞，37°C过夜培养。以T7为正链引物，HBXR为负链引物筛选阳性克隆。pUTPLTF ⅡB亦为哺乳动物细胞表达质粒由村上教授提供。所有突变体均经Taq测序试剂盒(Promega)和DNA测序仪(370A，Applied Biosytem)测序。

二、重组蛋白质的诱导和纯化

GST融合蛋白mol表达质粒转化至JM109大肠杆菌(E.coli.)，单菌落接种至含有Amp的LB培养基中，37°C过夜培养，转种于250ml含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为0.4mol IPTG(isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside)，30°C培养5～6小时，离心收集细胞，溶解于PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.5,含1%Triton-100)，超声波细胞打碎仪打碎细胞后加入谷胱苷肽Sepharose 4B树脂(Pharmacia Biotech. Inc.)，4°C旋转温育1小时，经PBST洗涤3次后，结合蛋白用10mmol/L还原型谷胱苷肽洗脱，蛋白质贮存于-80°C。

组氨酸(Histidine)融合蛋白表达质粒被转化至BL-21(E.coli.)。细菌接种至含Amp的LB培养基中，同时加入终浓度为1mol IPTG，30°C5～6小时培养后，收集细胞并由超声波粉碎仪打碎细胞，加入Nickle Sepharose树脂(Invitrogene Co.)，4°C旋转温育1小时，用TBS缓冲液(50mol Tris HCl,pH7.5, 150mol NaCl,1%Triton-100)洗涤5次，然后由依咪哒唑(Imidazole)缓冲液(300mol Imidazole, 20mol Na₂HPO₄,500mol NaCl,pH4.0)洗脱，蛋白质贮存于-80°C。

三、Pull-Down试验

约1μg GST或GST融合蛋白被吸附于谷胱苷肽Sepharose 4B树脂上，在GBT缓冲液中(10%甘油，50mol Hepes NaOH pH7.5, 50mol KCl, 7.5mol MgCl₂,0.1mol EDTA, 0.1mol二硫苏糖醇(DTT)，1%Triton-100)，加入100～200ng靶蛋白以及终浓度为1%牛血清(BSA)，4°C旋转温育2小时，经GBT缓冲液至少洗涤5次，结合蛋白由12.5%SDS/PAGE分离，Western Blot检测结果。

四、Far-Western Blot试验

约5～6μg GST融合蛋白，10×HMK缓冲液(20mol Tris HCl pH7.5,100mol NaCl,12mol MgCl₂)，新鲜配制的cAMP依赖的蛋白激酶(PKA，Sigma)，1μci/μl r-³²P ATP(Amersham)，1mol DTT在室温下温育1小时，经Sephadax柱纯化，放射自显影检测表记结果，-20°C贮藏备用。被结合蛋白经12.5%SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维膜上。5%牛乳阻断，然后将膜与10ml蛋白结合反应液，包括GBT缓冲液，终浓度为1%的BSA，2mol未标记的ATP，1mg/ml GST蛋白γ-³²P标记的探针(40～100ng/ml蛋白质，2×10⁶ cpm/μg蛋白质)一起在室温下温育1小时，GBT至少洗涤3次，每次10分钟，IP(Image Plate)曝光，读片(Fuji,Bas 100)。

五、联合免疫沉淀和Western Blot试验

约1×10⁵ Hepa G2细胞接种至直径为6cm塑料培养皿中(GIBCO),37°C，5%CO₂条件下培养24小时；将20μg不同组合的pNKFlag HBV X蛋白和pUTPL TF ⅡB DNA,0.5ml 0.25mol CaCl₂,0.5ml 2×BES［N，N-双(乙羟乙基)-2-氨基乙磺酸］(Sigma)混匀，室温下旋转摇匀1小时，加至Hepa G2细胞中，3%CO₂，35°C温育24小时，用10%FCS的DEME培养(GIBCO)清洗，加入10ml DEME(10%FCS)10ml培养24小时。离心收获细胞，在LAC缓冲液中(10%甘油，20mol Hepes NaOH pH7.5,50mol KCl, 0.4mol NaCl, 10mol MgCl₂,0.1mol DTT,0.1mol EDTA,9mol CHAPS,0.5mol PMSF,10μg/ml aprotinin和leupeptinin用超声波将细胞打碎，100μl裂解液与400μl裂解缓冲液(20mol Tris HCl pH8.0,180mol NaCl, 1mol EDTA,0.5% Triton-100)混匀，加入Anti-Flag M2树脂(Kodak)，在冷房(4°C)温育6小时，经TBS缓冲液(500mol Tris HCl,150mol NaCl pH7.4)洗涤后，用0.1mg/ml Flag-peptide(Kodak)洗脱结合蛋白。经12.5%SDS/PAGE电泳后转移至硝酸纤维膜。5%牛乳阻断，与第一抗体(抗-TFⅡB，由日本金泽大学肿瘤所村上教授提供)室温温育1小时充分洗涤，然后与Protein A一起温育1小时，经增强化学发光系统(ECL，Amersham)检测。

结果

一、确定HBV X蛋白结构内结合TFⅡB的部位

HBV X蛋白由154个氨基酸组成，其C-末端具有转录激活作用，而N-末端则能抑制转录^［6］。为了确定HBX结构内结合TFⅡB的位置，本研究按照图1A所示纯化了HBV X蛋白全长和截短突变体GST融合蛋白如图1B；应用Pull-Down试验，结果表明HBV X蛋白的C-末端是结合TFⅡB部位如图1C，X199是结合TFⅡB的最小基团。而N-末端XD5不结合TFⅡB。另一证明体外蛋白与蛋白结合的方法Far-Western Blot试验结果与Pull-Down试验结果完全一致，见图1D。本结果提示HBV X蛋白转录活性基团C-末端与TFⅡB结合是其发挥转录激活作用的机制之一。