一、基因疫苗的发现

1990年Wolff等^［1］试图用注射方法促使小鼠的肌细胞吸收质粒DNA以产生新的蛋白质。设置的对照组在注射DNA时未加任何化学佐剂，出人意料的是对照组动物的肌细胞吸收了这种裸露的质粒DNA后，能高水平地表达外源蛋白。进一步研究表明，直接给动物接种编码抗原的基因片段可使该动物获得对该抗原的免疫力，即将编码某种蛋白的外源基因直接导入动物细胞可达到免疫接种的目的。所接种的核酸(DNA或RNA)既是载体，又是抗原的来源，具有疫苗的功能，可称为基因疫苗或核酸疫苗。目前研究最多的是DNA疫苗，由于此疫苗不需任何化学载体，故又称为裸露DNA疫苗(naked DNA vaccine)。

二、基因疫苗的作用机制

基因疫苗一般由病原体抗原编码基因和以真核细胞作为表达载体的质粒构成。抗原编码基因的表达产物为病原体的有效抗原成分，可引起保护性免疫。载体质粒多以pBR322或pUC质粒为基本骨架，带有细菌复制子(ori)，能在大肠杆菌内高效稳定地复制，但缺乏在哺乳动物细胞内复制的能力。基因疫苗激活免疫系统的详细机制尚不十分清楚。一般认为，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主骨骼肌细胞或皮肤细胞后，可在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，经加工后形成的多肽抗原可与宿主细胞MHC I类和II类分子结合，并被提呈给宿主的免疫识别系统，从而可引起特异性体液和细胞免疫应答^［2］。肌细胞吸收和表达外源DNA的效力较高，这可能与肌细胞本身的结构特点有关^［1］。Wolff等发现组织培养的肌细胞通过T小管和细胞膜穴样内陷可将质粒纳入。Vahlsing等^［3］认为，肌细胞可能作为一种中心成分直接参与诱导免疫应答。另一种观点是，肌细胞的直接参与并非必需，目的基因从肌细胞分泌出来后，被巨噬细胞和/或树突状细胞吞噬、处理、提呈，分别在MHC I和II类分子的限制下，诱导CTL前体、B细胞和特异性T_H细胞^［4］。还有一种解释是用DNA免疫时，肌细胞和抗原提呈细胞(APC)均被转染，引起CD4^＋、CD8^＋、T细胞亚群的同时活化，从而产生特异性细胞免疫应答。

三、基因疫苗的特点

基因疫苗与传统疫苗、基因工程疫苗相比，具有以下特点。

(一)直接DNA接种，避免了制备传统疫苗、基因工程疫苗的繁琐过程。

(二)基因疫苗接种后蛋白质抗原从细胞内表达可提供内源性抗原多肽，此抗原多肽可直接与MHC I类与II类分子结合形成免疫复合物，和减毒活疫苗或载体活疫苗一样能引起CTL反应，但不存在后两者的毒力回升等危险。

(三)基因免疫时产生的抗原多肽的提呈过程和自然感染时相似，以其天然构象被提呈给免疫识别系统，此一特性对于构象型抗原表位引起的保护性免疫尤为重要，而用目前的重组技术在体外合成的蛋白抗原常造成构象型抗原表位的改变或丢失。

(四)基因疫苗具有共同的理化性质，为联合免疫提供了可能。

(五)作为一种重组质粒，基因疫苗能在大肠杆菌工程菌内快速增殖，且提取纯化简便，可大幅度降低成本，省时省力。

(六)具有同种异株交叉保护作用。

基因疫苗的安全性是人们关心的重要问题。在理论上存在导入的外源DNA整合入宿主细胞基因组的可能，并导致细胞癌基因的顺式或反式激活、抗癌基因的失活等，使细胞发生恶性转化。但通过甲基化分析、酶切分析和PCR等技术的研究结果表明，进入骨骼肌细胞的DNA分子独立存在于细胞质中，未发现复制或整合^［5］。另一问题是有可能引起抗-DNA抗体和自身免疫性疾病。但Robertson^［6］最近研究表明，裸露的双链DNA分子很难引起抗-DNA抗体反应。

四、某些传染病基因疫苗的研究现状

(一)流感DNA疫苗1993年Robinson等直接将编码流感病毒血凝素(HA)的DNA肌注小鸡和小鼠，结果这些动物产生了抗HA特异性抗体并能抵抗嗣后致死剂量流感病毒的攻击。后来用DNA滴鼻接种，亦能诱导呼吸道粘膜抗病毒的免疫保护作用。

甲型流感病毒经常发生变异，从而逃避免疫系统的监视，使原有的疫苗对新毒株不起作用。1993年Merck研究室的Ulmer等^［7］选择甲型流感病毒中序列保守的核蛋白(NP)基因制备DNA疫苗。将高度保守的流感病毒A/PR/8/34株的NP编码基因接种在Rous肉瘤病毒或CMV启动子的控制下。将质粒直接注射BALB/C小鼠四头肌后，NP基因在小鼠内转录成mRNA后表达了NP蛋白。在致死剂量同型病毒异源毒株A/HK/68或A/PR/8/34株(两株为不同亚型，分离时间相隔34年)的攻击下，免疫小鼠的存活率为90%，而注射空白载体(无NP序列)的小鼠存活率为0，未注射的小鼠存活率为20%。经纯化的NP蛋白免疫后产生抗NP蛋白抗体的小鼠以及输入高效价的抗NP抗体小鼠，均不能抵抗病毒攻击，说明抗NP蛋白抗体介导的体液免疫无效，而CTL介导的细胞免疫则能防御动物感染流感病毒。可见基因疫苗的作用机理与传统疫苗不同。

(二)艾滋病DNA疫苗1993年Wistar研究所的科学家给小鼠和非人灵长类动物的肌肉注射含有HIV-1包膜蛋白(env)基因的质粒PM160，结果产生了抗HIV-I env的特异性抗体，它能中和HIV-1感染，在体外能抑制HIV-1介导的合胞体形成以及CD₄与gp120结合。同时还观察到特异性T细胞增殖和CTL应答，表明HIV-1 env DNA可在宿主肌细胞内表达和加工。表达产物gp160被切割成gp120和gp41后，可折叠成天然结构，从而诱导全面的免疫反应。诱生的特异性抗体不仅可与gp120和gp41结合，还能与tat、rev基因产物反应，这是mRNA发生剪接的结果。

美国Agracetus公司正在非人灵长类动物中试验HIV和猿猴免疫缺陷症病毒(SIV)gp120亚单位疫苗，预计进入人体试验至少还需一年。质粒DNA gp120和重组DNA gp120疫苗不同，后者为细胞外传递，而前者由细胞内表达产生。因此，虽然gp120疫苗在其他系统中效果不佳，但其DNA疫苗可能有效^［8］。

研制艾滋病疫苗的最大障碍之一就是HIV是一种变异率极高的RNA病毒，对某些HIV株有效的疫苗对同时大量存在的变异株可能完全无效。上述流感疫苗的研究结果给艾滋病疫苗的研究提供了一条新思路，HIV包膜蛋白变异性很大，这与流感病毒相似，但其核心蛋白高度保守。因此，通过基因疫苗方法将HIV-C cDNA导入体内，表达C蛋白后，借助CTL介导的细胞免疫，能否预防HIV感染，颇值得探索。同理，也为目前面临困境的丙型肝炎疫苗研制提供一条新思路，具有一定指导意义。

(三)狂犬病DNA疫苗狂犬病病毒(RV)糖蛋白与RV的致病性有关，又可诱生保护性中和抗体。1994年Xiang等^［9］将编码RV糖蛋白的cDNA插入质粒DNA，在SV40早期启动子控制下表达。用该质粒DNA直接注射小鼠腓肠肌，免疫3次，间隔23周，每次150μg。免疫后小鼠产生了抗RV中和抗体、抗RV糖蛋白特异性CTL和分泌淋巴因子的T_H细胞，末次免疫后2周用半数致死量(LD₅₀)病毒标准株(CVS)攻击，结果均获得完全的保护；而用空白载体质粒免疫的对照组在相同剂量攻击下14天内全部死亡。

(四)乙型肝炎(乙肝)DNA疫苗由于HBV变异及宿主免疫耐受等因素，使乙肝疫苗接种可能失败，给乙肝预防带来困难。基因疫苗能否解决这些问题，值得研究。Davis和Whalen已在小鼠中证明用含编码HBsAg及pre S基因并有真核细胞启动子的重组质粒DNA免疫，可诱生抗HBs和致敏CTL产生。最近，在黑猩猩中进行的实验说明，用2mg裸DNA作肌肉注射，一次免疫后即可诱生抗-HBs达100mIU/ml，再刺激后，抗-HBs效价可达14 000mIU/ml。然而如仅用400μg的HBV DNA免疫则一次免疫后未能测出抗HBs，如再刺激后，则仅有60mIU/ml，而且抗-HBs持续时间短暂。实验结果提示，这种疫苗不仅可预防HBV感染，而且极可能发展为可供治疗乙肝患者的治疗用疫苗^［10］。

(五)单纯疱疹DNA疫苗最近Kriesel等^［11］将编码HSV-2型gD₂和pRSV_nt免疫BALB/c小鼠，13天后用半数致死量的HSV攻击，获得满意结果，而对照组的小鼠均先后死亡，表明单纯疱疹DNA疫苗对动物有保护性作用。

(六)结核病DNA疫苗麻风杆菌中分子量为65KDa的热休克蛋白具有高度保守性，它与结核杆菌的抗原非常相似，单独以该抗原免疫即可获得有效的保护作用。1994年Lowrie等^［12］以含该基因的质粒DNA肌注免疫小鼠，用结核杆菌感染，然后检查肝脏内的活菌数，结果表明，裸露DNA免疫与常规卡介苗有相似的保护作用。

(七)疟疾DNA疫苗1994年Sedegah等构建的质粒DNA中含有编码尤氏疟原虫环子孢子蛋白(PyCSP)的基因。该疫苗与目前试验中的疫苗(辐射处理的子孢子)相比，能诱导更高水平的抗PyCSP抗体和CTL，并使16只免疫小鼠中的9只获得了对疟原虫感染的防御作用。最近研究表明疟疾基因疫苗有可能成为最早用于人类的基因疫苗^［13］。

五、基因疫苗面临的挑战及展望

基因疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一，特别是其研究方向与世界卫生组织儿童计划免疫长远目标(用一种疫苗预防多种疾病)相吻合。基因疫苗不仅能预防疾病，还可做为治疗用疫苗来治疗一些复杂难治的疾病^［14］，例如病毒性肝炎、癌症等。这些均已显示出基因疫苗的巨大潜力和应用前景^［15］。但是，基因疫苗的历史毕竟很短，