【摘要】目的研究乙型肝炎病毒(HBV)感染经精子传播的可能性。方法检测慢性乙型肝炎(乙肝)患者精子中的HBV DNA(地高辛配基标记探针原位杂交及³²P标记探针Southern吸印杂交法)；并用正常人精子进行HBV DNA俘获试验；对引产胎儿标本进行HBsAg、HBcAg(ABC免疫组化法)及HBV DNA的检测。结果在22例慢性乙肝患者精子标本中，3例检出HBV DNA，分布于精子的膜部和核心部。对母亲无HBV感染、父亲为慢性HBV感染者的4例胎儿的检测表明，在1例胎儿的肝、小肠、肾、肺、骨骼肌中检出了3.2kb的游离型HBV DNA及HBsAg、HBcAg的表达；该胎儿的父亲精子亦检出HBV DNA。体外试验表明正常人活精子能俘获HBV DNA，被俘获的HBV DNA在精子内的分布位置与乙肝患者精子相同。结论乙肝病毒可能通过感染精子垂直传播，精子被感染的机制涉及对HBV DNA的主动性捕获。

Study on HBV vertical transmission via infected spermatozoaZhao Liansan, Liu Xiaosong, Zhang Zhixiang, et al.The First Affiliated Hospital, West China Medical University, Chengdu 610041

【Abstract】ObjectiveTo study the possibility of HBV infection transmitted by infected spermatozoa.MethodsHBV DNA of spermatozoa samples from patients with chronic hepatitis B was detected by southern blot and in situ hybridization using ³²P labeled probe and Dig-labeled probe respectively. Capturing test of HBV DNA was performed in healthy spermatozoa. HBsAg、HBcAg(ABC immunohistochemistry) and HBV DNA from aborted embryo samples were detected.ResultsThree of the spermatozoa samples got from 22 cases of patients with chronic hepatitis B were HBV DNA positive, which were found to be located at the membranes and cores of spermatozoa heads. Embryos, which were aborted from 4 healthy women whose husbands were suffering from chronic hepatitis B, were examined for HBV infection in the various organs. In one of the 4 embryos, whose father was the only one with spermatozoa HBV DNA positive among all the 4 fathers of the embryos, 3.2kb full-length genome of free-type HBV DNA and its expression products(HBsAg or/and HBcAg) were detected in the liver, small intestine, kidney, lung, and skeletal muscle tissues, etc.. In vitro test showed that HBV DNA could be actively captured by healthy living spermatozoa and distributed at similar sites as in those spermatozoa got from chronic hepatitis B patients mentioned above.ConclusionIt was possible that HBV infection could be vertically transmitted via infected spermatozoa by which the HBV were actively captured.

【Key words】Hepatitis B virusVertical transmissionSpermatozoa

性传播和垂直传播是乙型肝炎病毒(HBV)感染的传播途径之一，Blumberg^［1］曾推测HBV DNA可能整合入宿主生殖细胞基因中然后在子代中传播。周思亮等在卵细胞、各级生精细胞及成熟精子中检出HBV DNA，为HBV经生殖过程垂直传播给子代的可能性提供了依据^［2～5］。我们对HBV感染经精子传播的可能性及其机制进行了深入的研究。

材料和方法

一、标本收集

(一) 精液标本分别采自：1. 22例男性慢性乙型肝炎(乙肝)患者，年龄19～25岁；2. 1例健康男子，30岁，无肝病史，体检及肝功能均正常，血清无HBV感染标志，有生育能力。为保持精子活力，采集后的精液标本立即进行实验。

(二) 胎儿标本的纳入标准均系因医学理由引产，胎龄3～6月。引产前检测其父母血清HBV感染标志物：胎儿母亲HBsAg、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc及抗-HBs均阴性，且PCR检测HBV DNA亦为阴性；胎儿父亲均系慢性HBsAg携带者。解剖收集胎儿标本的皮肤、肌肉、食管、胸腺、肺、脾、肝、肾、心脏、大血管、膈肌、小肠和脑组织，一式2份。1份置-70°C保存，1份用10%福尔马林固定，石蜡包埋。1988～1993年间共筛选250对引产夫妇，符合纳入标准者14例；其中4例同时采集到胎儿父亲精液标本，将其编为1～4号纳入本组分析。

二、试剂

HBV DNA pBR325重组质粒(AM12)系上海肿瘤研究所顾建人教授惠赠；³²P-HBV DNA探针及地高辛配基标记的Dig-HBV DNA探针系我室制备；耐热DNA聚合酶(复旦大学遗传所)，羊抗-HBs、兔抗-HBc(美国DAKO公司)，免疫组化ABC试剂盒(美国Vector公司)。

三、方法

(一) 精液DNA抽提物斑点杂交参照文献［6］进行。

(二) 精子DNA的Southern吸印杂交将精液标本用PBS反复洗涤，离心去除精浆成份；待末次洗涤液经斑点杂交检测HBV DNA结果阴性，证实精子细胞外膜物理吸附的HBV已完全洗脱后，将精子悬液分为一式2份；1份用于原位杂交，另一份常规酚/氯仿抽提精子DNA用于Southern吸印杂交，方法参照文献［7］，并设置阳性、阴性对照。

(三) 精子原位杂交取上述已彻底洗涤后的精子悬液每例各5μl涂片，干燥后丙酮固定；按文献［8］的方法以Dig-HBV DNA探针进行原位杂交。试验中设置阳性、阴性对照、和不加探针的空白对照。

(四) 精子俘获HBV DNA试验将采得的正常人精液置37°C待其液化，然后一式两份：(1) 1份用BWW改良配方工作液^［9］10ml洗涤二次，离心600g×6分钟，去上清；精子沉淀再悬于BWW液中配成10⁷条/ml的精子悬液；取精子悬液0.6ml在37°C、5% CO₂的条件下获能培养5小时，将其中0.3ml加入纯化的全基因组HBV DNA，使终浓度为0.2μg/ml；其余0.3ml不加HBV DNA作空白对照；将此两标本继续培养1小时，以PBS洗涤后，分别用于原位杂交和Southern吸印杂交。(2) 另1份精液用PBS洗涤3次置4°C冷处理24小时，经镜下观察精子已完全丧失活动确定其死亡后，按上述活精子的实验步骤处理。

(五) 胎儿组织的HBV DNA检测将-70°C保存的标本以酚/氯仿抽提DNA后，进行Southern吸印与³²P-HBV DNA探针杂交。

(六) 胎儿组织石蜡包埋切片标本HBsAg、HBcAg的免疫组化检测按药盒说明书进行。

(七) HBV DNA检测用于检测胎儿母亲血清、胎儿父亲精子及胎儿器官组织的DNA抽提标本。PCR引物对应于HBV基因组C区(由中科院上海细胞所合成)。PCR反应共循环30次，产物预期长度为605bp；电泳后，经Southern吸印与³²P-HBV DNA探针杂交以进一步确认。每次试验均设置阴性，阳性和空白对照。

结果

一、HBV DNA在慢性乙肝患者精子中的存在

本组22例慢性乙肝患者的精液经斑点杂交，有14例(63.64%)HBV DNA阳性。经彻底洗去精浆后的精子标本分别作Southern吸印杂交和原位杂交，其中有3例(例A、例B、例C)为阳性。例A的精子标本经Southern吸印杂交检出整合型HBV DNA，但原位杂交阴性；例B系Southern吸印杂交阴性，而原位杂交结果HBV DNA阳性；例C则二者均为阳性，且Southern吸印杂交结果显示检出的HBV DNA为游离复制型。精子细胞由头、尾两部组成，头部又分为顶体部、膜部、和核心部。原位杂交阳性的标本，镜下显示HBV DNA均位于精子头的膜部和核心部，未见位于顶体部者。

二、正常人精子俘获HBV DNA

死精子加入HBV DNA温育后的Southern杂交和原位杂交结果均为阴性，不加HBV DNA的活精子及死精子对照组和空白对照组的检测结果亦均为阴性；而活精子加HBV DNA温育后经Southern杂交检出游离型HBV DNA，原位杂交可见约10%的精子HBV DNA阳性。被俘获的HBV DNA在精子内的存在部位不定，部分精子中HBV DNA位于膜部，部分位于膜部和核心部，未见有存在于顶体部者，与上述乙肝患者所见HBV DNA在精子内的分布部位相似。

三、4例胎儿及其父亲的HBV感染检出情况

(一) 父亲血清和精子中的检测结果4例胎儿父亲均系血清HBsAg阳性。其中，1号、2号胎儿父亲血清HBV DNA阳性。4例精子标本原位杂交及抽提DNA后直接进行Southern吸印杂交，结果均未能检出HBV DNA；而将DNA抽提标本经PCR扩增后，产物电泳虽肉眼未见阳性条带，但经Southern吸印与³²P-HBV DNA探针杂交后曝光5天，1号胎儿父亲精子标本PCR产物在预期长度片段0.6kb处显示出阳性条带，表明该例精子标本内存在HBV DNA，惟拷贝数较低。4例精子标本的最后1次洗涤液PCR扩增后产物肉眼观察及Southern吸印杂交均未见阳性条带，说明洗涤步骤业已将精子外膜物理吸附的HBV DNA彻底去除。

(二) 胎儿体内的检测结果在1号胎儿的肝、肺、肾、小肠及骨骼肌组织中分别检出了HBV DNA、HBsAg、及HBcAg(见附表)。所检出的HBV DNA为3.2kb大小，提示为游离型的完整HBV DNA分子，并有HBsAg及HBcAg蛋白表达。其余2号、3号、4号胎儿标本同时进行的检测结果为阴性。

附表1号胎儿组织HBV DNA、HBsAg、及HBc