关键词： 钩端螺旋体；套式PCR；检测

摘要目的用套式 PCR 快速检测水沟和丛林等地的钩端螺旋体。方法选 Leptospira borgpetersenii 中的一段保守序列 IS1533，设计两对引物，用套式 PCR 检测六种不同血清型的钩体。结果6株致病株均出现单一246bp 的特异性扩增产物，而腐生株、空白对照无任何 DNA 扩增条带。用琼脂糖凝胶电泳，能检测500fg 模板的扩增产物。结论套式 PCR 是一种灵敏度高、特异性强的快速检测自然疫源中钩体的有效方法。

DETECTION OF SIX SEROVARS OF PATHOGENIC LEPTOSPIRES BY NESTED PCR

Wan ChengsongZhang WenbingZhao WeiCao Hong

(Department of Microbiology,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)

ABSTRACTAimTo rapidly detect Leptospira in ditch and jungle by nested PCR.MethodsTwo sets of primers were derived from an inserted sequence IS1533 of Leptospira borgpetersenii.Six serotypes Leptospires were detected by nested PCR.Results A specific amplification product with 246bp length could be found from six serovar pathogenic Leptospires by nested PCR,and agarose gel electrophoresis is demonstrated to have a sensitivity of detecting 500fg DNA amplification products.Conclusion Nested PCR is a rapid,specific and sensitive method for detecting Leptospira in the epidemic regions.

KEY WORDSLeptospira Nested PCR Detection

钩端螺旋体(简称钩体)病是一种人畜共患自然疫源性疾病，具有稻田、洪水、雨水和丛林等流行形式。钩端螺旋体种类繁多，分致病性和非致病性两大类，致病性钩端螺旋体全世界已发现25个血清群、200多个血清型。我国常见致病性钩端螺旋体有14个血清群，主要分布在云南、广东、福建和湖北等东南沿海和长江流域^［1］。对钩体进行及时监测，是防治钩体病大规模流行的重要措施。我们应用套式 PCR 对不同血清型的6株致病性钩端螺旋体进行了研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株标准血清型菌株：波摩那型(L.pomona)109株、秋季型(L.autumnalis)临4株(56060)、犬型(L.canicola)桂44株、赖型(L.lai)70091株、七日热型(L.hebdomadis)401株和临海型(L.grippotyphosa)临6株等购自中国医学细菌保藏管理中心钩端螺旋体专业实验室；腐生株由中山医科大学微生物学教研室惠赠。

1.1.2实验动物所用家兔由本校实验动物中心提供。

1.1.3主要仪器及试剂M750—B 型紫外分光光度计、TGL—16G 高速离心机、PCR 扩增仪(ERICOMP，INC.)、DNA 分子量标准品、Taq DNA 聚合酶和4种 dNTP (上海复华公司)及SDS、琼脂糖。

1.2方法

1.2.1兔血清的制备抽血50～70ml,置100ml 瓶中4℃过夜，取血清56℃灭活30min破坏补体，用孔径0.22μm的滤膜过滤除菌。

1.2.2钩体的培养柯氏(Korthof)培养基(pH7.2)^［2］15磅15min灭菌后，加入10%兔血清，接种钩体，28℃恒温培养2周，暗视野显微镜下检测其生长和死亡情况。

1.2.3DNA 提取钩体纯培养物200μl反复冻融2～3次，13，000g(14,000r/min)离心15min，用1mlTE缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)洗涤沉淀1次，将沉淀重新悬浮于0.5mlTE 缓冲液中。加终浓度0.5%的SDS，50℃作用1h。加终浓度为3mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30min或加终浓度为0.4mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴30min，酚/氯仿法抽提 DNA。

1.2.4DNA 定量取不同稀释度的 DNA 液于紫外分光光度计上测260nm和280nm的吸光值，判断其纯度，并计算浓度。

1.2.5引物合成选 Leptospira borgpetersenii 中的一段保守序列IS1533^［3］，采用 PRIMER 软件设计两对引物，并由上海生物工程中心合成。两对引物的序列如下：

外引物W1：5’ -GGCCGGTTCGTTCATGAGTT- 3’(848—867)

W2：5’ -TCGGGAGCTATTCTTAGTCT- 3’(1337—1316)

内引物W3：5’ -GGACAACCTGCATTAGTCGT- 3’(1031—1050)

W4：5’ -CTCTCGCCAACAAGTATTCC- 3’(1276—1255)

1.2.6PCR 和套式 PCRPCR 反应总体积为50μl，其中模板 DNA 5μl、10×buffer 5μl、2mM dNTP 5μl、10μM 引物各为1μl、TaqDNA 聚合酶0.5μl(1U)，加灭菌三蒸水使总体积为50μl，液体石蜡油50μl覆盖。阴性对照分别采用腐生株、大肠杆菌 DNA 为模板另设置不加任何 DNA 模板的空白对照。

用外引物作第一次 PCR 扩增，反应参数为94℃ 5 min；94℃30sec，50℃30 sec，72℃60 sec，共30个循环；72℃5 min。取第一次 PCR 产物，稀释1000倍，用内引物再次扩增，反应参数同上。

1.2.7电泳检测PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察，拍照记录。

1.2.8敏感性检测取流感伤寒型和七日热型菌液 DNA 定量并经一系列 10倍稀释后作 PCR ，电泳检测扩增产物。

2结果

2.1外引物的扩增结果经过外引物扩增，赖型70091株、临海型临6株和七日热型401株能获得490bp的特异性 DNA 带，秋季型临4株有非特异性带，而犬型桂44株、波摩那型109株无 DNA 带(图1)。

图1.用外引物检测钩体的第一轮 PCR 扩增结果

M DNA 分子量标准品1 赖型70091株2 犬型桂44株3 秋季型临4株4 波摩那型109株5 临海型临6株6 七日热型401株7 空白对照

Fig.1The results of amplification with primer W1/W2 for deteceing Leptospira by first round PCR

M:DNA marker1.L.Lai2.L.Canicola3. L.Autumnalis4.L.pomona5.L.Grippotyphosa6.L.hebdomadis7.blank control

2.2套式 PCR 的扩增结果6株致病株均出现单一的246bp特异性带，而空白对照无 DNA 带(图2)。

图2.用内引物检测钩体的第二轮扩增结果

M DNA分子量标准品1 赖型70091株2 犬型桂44株3 秋季型临4株4 波摩那型109株5 临海型临6株6 七日热型401株7 空白对照

Fig.2The results of amplification with primer W3/W4 for deteceing Leptospira by second round PCR

M:DNA marker1.L.Lai2.L.Canicola3. L.Autumnalis4.L.pomona5.L.Grippotyphosa6.L.hebdomadis7.blank control

2.3套式 PCR 检测的敏感性将临海型临6株和七日热型401株的模板 DNA 定量，用外引物扩增，琼脂糖凝胶电泳能检测到5pg 模板的扩增产物。琼脂糖凝胶电泳能检测到500fg的扩增产物(图3)。

图3套式 PCR 检测七日热型 401株 DNA 模板的敏感性

(A)用外引物扩增(B)用内引物扩增

Fig.3The identification of PCR sensitivity for detecting DNA template from L.hebdomadis

(A)The results of amplification with primer W1/W2(B)The results of amplification with primer W3/W4

1.50ng2.5ng3.500pg4.50pg5.5pg6.500fg7.50fg

3讨论

对致病性钩端螺旋体的检测和鉴定，常采用暗视野镜检法、直接培养法、动物试验法和凝集溶解试验等传统方法^［4］。这些方法耗时数周，且需一套活钩体标准菌种及暗视野显微镜，给钩体检测带来一定困难^［5］。PCR 技术用于检测病原体具有操作简便、灵敏、快速等特点，其关键在于设计特异性的引物。

IS1533是Leptospira borgpetersenii 中的一段插入序列，其相关序列在致病性钩体中广泛存在，但拷贝数和基因位置在不同血清型中有所差异。根据该序列设计和合成的引物对保存在美国钩体病资源中心的182株致病性钩体的 DNA 进行扩增，结果177株获得阳性结果，与血清学检测的符合率为97%^［6］。