关键词： 恙虫病东方体；序列分析；核苷酸；同源性；sta56

摘要目的了解恙虫病东方体 cMY 株与其它株的关系。方法测定 CMY 株 sta56基因片段的核苷酸序列并与其它株相应序列进行比较。结果在测定的324bp序列中，GC 含量为43.5%；与Karp、Gilliam、Kato、kuroki、Kawasaki及Shimokoshi 株相应序列的同源性分别为91.0%、87.3%、87.0%、87.3%、86.1%及 73.8%。结论CMY 株与已报道的恙虫病东方体菌株不同，与 karp 株有很高的同源性。

SEQUENCING OF A PARTIAL STA56 GENE OF oRIENTIA TSUTSUGAMUSHI CMY

Chen TianshengTan LixiaLuo huiminXu Manbo

(Institute of Epidemic Control and Prevention,Health and Epidemic Prevention

station of Guangdong Province,Guangzhou 510300)

ABSTRACTCMY is a strain of Orientia tsutsugamushi isolated from a Cantonese Patient in Guangzhou in 1987. Restriction analyses of sta58 gene revealed that strain CMY is different from strains Karp and Gilliam.In order to know its relation with the other oriential strains,partial sta56 gene of strain CMY was cloned (recombinant plasmid pTR2) and sequenced.In the 324bp sequence,G+C content is 43.5%. Its nucleotide homology with strains Karp, Gilliam, Kato, Kuroki, Kawasaki and shimokoshi are 91.0%, 87.3%, 87.0%, 87.3%, 86.1% and 73.8% respectively.So, strain CMY is a new strain of Orientia tsutsugamushi, different from the strains mentioned above, and strains CMY and Karp may be classified into the same type since they have a high nucleotidehomology.

KEY WORDSOrientia tsutsugamushi Sequencing nucleotide Homology sta56

恙虫病东方体属只有一个种，但不同菌株之间无论在抗原性抑或毒力等方面均存在差异^［1］。恙虫病东方体菌株的鉴别过去多采用免疫学方法即鉴别其抗原性差异，随着分子生物学技术如核酸杂交、核苷酸序列分析及聚合酶链反应技术的建立和发展，对菌株的分析鉴定也进入到基因水平，即对其 dNA或基因进行分析，从而作出鉴定或比较不同菌株之间的差异。目前研究得最多的恙虫病东方体基因是 sta56 基因^［2、3］(日本学者采用不同命名方法^［4、5］)，即编码恙虫病东方体56kD 主要外膜蛋白抗原的基因。美国学者 Stover 等报告了Karp株sta56基因全序列^［2］，日本学者 ohashi 等报告了 Gilliam、Kato、Kuroki、Kawasaki 及 Shimokoshi 5株恙虫病东方体的 sta56 基因全序列^［4、5］。Ohashi 还根据这6个序列之间的同源性大小绘制出反映6株恙虫病东方体之间亲缘关系的进化树^［5］。

CMY 株是由中山医科大学微生物学与免疫学教研室于1987年从广州市患者血标本中分离到的一株恙虫病东方体。作者曾以该株及 karp,Gilliam 株为对象克隆了 sta58基因的部分片段，并结合内切酶分析证实 CMY 株不同于 Karp 株^［6］和Gilliam株(博士学位论文，待发表)。考虑到发表的sta58基因序列仅一个，而sta56基因序列已达6个，故又分析了 CMY 株sta56基因部分序列并与其它6株恙虫病东方体相关序列作一比较。

1材料与方法

1.1CMY 株恙虫病东方体 DNA1992 年初用 CMY株感染小鼠，待其发病后，取血、腹水及脾，分别提取 DNA,方法参见文献^［7］，-30℃保存至今。

1.2恙虫病东方体sta56 基因特异 DNA 引物 Rt34、Rt55、Rt10及Rt11由中山医科大学寄生虫学教研室黎家灿教授提供，其序列分别对应于Furuya^［7］的引物34、55、10及11序列，唯去掉了引物5′端接头。PCR试剂盒为上海复华公司产品。克隆试剂盒pGEM-T Vector System I 为 promega 产品。宿主菌用HB101。

1.3靶基因的扩增按试剂盒说明书操作，循环参数见文献^［7］。先用引物 rt34 及 Rt55， 以 CMY 株 DNA 为模板进行首次扩增，再取其 PCR产物(2μl)，用引物 Rt34 及 Rt11 进行二次扩增(即半套式扩增)。

1.4靶基因片段的克隆用低熔点琼脂糖电泳回收靶片段，与质粒载体进行连接，转化宿主菌。按试剂盒说明书操作。用电泳法初筛重组质粒，再用酶切及 pCR 确证。

1.5核苷酸序列分析全自动测序仪型号为 ALFexpress,测序试剂盒用 cy5 AutoRead Sequencing Kit,均为 Pharmacia Biotech产品。方法为双脱氧链终止法。作者提供 20μg纯化的重组质粒 DNA样品，由北京发玛西亚生物技术中心代测序列，每段序列重复测3次。

1.6核苷酸序列同源性比较用 DNASIS软件将所得序列与已报告的6株恙虫病东方体 sta56基因序列进行同源性比较。

2结果

2.1重组质粒 pTR2 的构建以 CMY DNA为模板，先后用引物 Rt34、Rt55、Rt34、Rt11进行半套式 PCR扩增，PCR 产物用琼脂糖电泳可见约 870bp(参考 Karp sta56序列推算)，用低熔点琼脂糖电泳回收该带，与 pGEM-T质粒进行连接，构建了重组质粒 pTR2。以该重组质粒 DNA为模板，用恙虫病东方体 sta56 基因特异引物 Rt10 及 Rt11可扩增出约 500bp 带，进一步证实 pTR2为含有目的基因的重组质粒，可供序列测定。

2.2CMY 株恙虫病东方体 sta56 基因片段序列及与其它6株相应序列的比较见图1。在所测的324bp 中，GC 含量为 43.5%，经 DNASIS 分析，该序列与 Karp, Gilliam，Kato,Kuroki,Kawasaki及Shimokoshi株的同源性分别为91.0%，87.3%，87.0%，87.3%，86.1%及73.8%。其中与 karp 株同源性最高，可归为同一型。

图1CMY 株恙虫病东方体部分 sta56基因序列及与其它6株东方体相应序列的比较

Fig.1 Alignment of nucleotide sequence in partial sta56 gene of seven strains of Orientia tsutsugamushi,CMY,Karp,Gilliam,Kato,Kuroki,Shimokoshi and Kanasaki.3讨论

作者原计划能测出 pTR2中克隆片段的全序列，由于序列分析试剂盒的荧光物质是标记在测序引物上，而 pGEM-T 载体中 pUC/M13 正/反向测序引物结合位点之间有约 200bp序列，加上克隆的外源基因序列共约 1070bp,超出了机器的可读范围，致使克隆片段中间部位的序列分析结果重复性不好，作者只好放弃初衷，选择 rt34 引物下游重复性较好的 324bp序列，并以此为据与其它相关序列进行比较。每段序列经过3次重复测定，最终序列以能重复的结果为准。

借助序列分析技术，人们可准确地对恙虫病东方体菌株进行鉴定和分型。近来国内不少研究人员报告分离了许多恙虫病东方体菌株^［8、9］。有条件的实验室虽可用免疫学方法分型，但只能将菌株简单地区分为 karp,Gilliam 或 Kato型；而基层单位多由于缺乏商品化的分型血清而无法分型。为了解当地流行型别，只能采用血清流行病学方法鉴定为 karp,Gilliam，Kato或混合型，这种分型方法较粗糙，而且目前尚不清楚血清学结果是否与菌株鉴定结果一致，因而难以判断其流行病学意义。如果能用核苷酸序列分析技术测定这些菌株的部分 sta56基因序列并与已知序列比较，则可作出更精确的分型并了解菌株之间的演变关系。显然，这些工作对流行病学研究特别是追踪传染源极有实用价值。以 cMY株为例，患者在广州发病前曾去过广东省阳江市闸坡旅游，那么患者到底是在闸坡旅游时感染，还是在广州感染的呢?目前还是个悬案。但如果能分别从广州及阳江的宿主或媒介中分离几株恙虫病东方体并进行序列分析，通过比较它们之间的同源性即可弄清 cMY 株的最终来源。

在80年代前，我国恙虫病疫区主要集中在长江以南地区。80年代后，苏北、山东，进而东北地区均被证实为恙虫病疫区。这些新疫区的菌株与传统南方疫区的菌株有何区别，有何关系呢?东北地区北与俄罗斯，东与朝鲜接壤，三地之间的菌株有何关系呢?近几年来南方传统疫区的恙虫病病例似有增多趋势。各个疫区的优势菌株是哪种，它们有什么变化规律，彼此之间有什么联系呢?

这些疑问用传统的流行病学方法是难以解决的，唯有借助分子生物学新技术对病原体进行更深入的分析即分子流行病学研究才能有所突破。随着我国各地对恙虫病及其病原体研究的深入，我国防制恙虫病的工作也会提高到一个新层次。

4参考文献

1.于恩庶.恙虫病立克次体.见魏曦，主编.医用立克次体学.上海：上海科学技术出版社，1984，268～322.

2.Stover CK,Marana DP,Carter JM, et al.The 56-Kilodalton Major Protein Antigen gene of Rickettsia tsutsugamushi:Molecular Cloning and Sequencing Analysis of the sta56 Gene and Precise Identification of a Strain-Specific Epitope.Infect and Immun.1990,58:2076.

3.Oaks