卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii,Pc)于1988年被证明是一种真菌，主要引起免疫妥协患者，特别是感染HIV的AIDS患者的卡氏肺囊虫肺炎(PcP)。在临床和流行病学研究中，传统的表型分型方法，如用特异抗血清仅能区分来自不同宿主及不同地理区域的Pc，不能进行株鉴定，难以满足实际需要^［1～3］；现代的基因分型方法，因其分辨力和分型率高而倍受重视。由于感染人类的Pc尚不能人工培养，RFLP^［4］、PFGE^［5］等需用大量病原体的分型方法并不适合临床及环境样本中微量Pc的分析。因此，通过扩增Pc靶基因并以此分型的PCR分型方法应运而生，包括PCR直接测序法、PCR/SSCP法、型特异的探针杂交法及AS-PCR法。本文就其近年来的应用研究情况作一综述。

1以染色体rDNA分型

1.15SrDNA分型Latouche等^［6］用PCR扩增20份阳性支气管肺泡洗液(BAL)标本中的5SrDNA的120bp全长序列，经克隆后每份标本取3个克隆测序，结果发现了6个变异型。有的标本不止一个变异型，可能是不同Pc株在同一患者体内的共同感染或同一Pc株不同拷贝所致。因显示变异型的患者多接受了药物处理，变异似与药物选择的压力有关，尚需大量标本证实。但突变的随机分布使5SrDNA PCR分型似乎不太可靠。

1.226SrDNA分型Lu等^［7］对15份标本中Pc的18S、26SrDNA的小部分及5.8SrDNA的全部经PCR、克隆、测序后未发现变异。Hauser等^［8］采用PCR/SSCP(单链构象多态性)技术，即相同长度的DNA单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时的迁移率可因单一碱基的差别而造成构象的不同。对12份BAL标本中Pc的26SrDNA的426bp片段的分析发现了3个SSCP型，其中3份标本有2个SSCP型，提示可能存在共同感染。

1.3ITS分型ITS是rDNA的内转录间隔区，包括ITS1(位于18S 和5.8SrDNA间)和ITS2(位于5.8S和26SrDNA间)。Lu等^［7］用PCR测序法在15份标本中发现2个ITS1型(A、B)、3个ITS2型(a、b、c)，共4个ITS型。有3份标本存在2个ITS型，1份标本同时存在人型和大鼠型Pc序列。Latouhe等^［6］在13份标本中发现6个ITS1型、7个ITS2型，共10个ITS型。在法国和意大利两个不同地理区域间未发现ITS间的差异性。Latouche等^［9］又在36份BAL或痰液标本中发现8个ITS1型、7个ITS2型，共11个ITS型。有10例患者在PcP的特定病期显示相同的Pc株。有1例患者在PcP的几个病期均为同一株菌，可能是早期治疗时未消除菌的复活或同一株菌的重新再感染；有5例患者在PcP各个病期的Pc均不同，可能是新菌的再感染所致。Tsolaki等^［10］用PCR、克隆、测序法在死于PcP的6份肺组织标本中发现6个ITS1型、9个ITS2型，共9个ITS型，以B2al型最常见。由于某些位点碱基的插入，Lee等^［11］将原来157bp的ITS1修正为161bp，原来177bp的ITS2修正为192bp，用PCR测序法检测207份标本发现15个ITS1型(A～O)和14个ITS2型(a～n)，共59个ITS型，以Eg型最常见(占59例)。由于修正了ITS的碱基数目并扩大了标本量，许多新的基因型被发现，虽然ITS1序列中单个碱基的变异就可成为一个基因型，但不同标本或同一标本重复测序时在62～71区段内的连续10个碱基T的数量变化(8～12)未被用来分型，Tsolaki等^［12］认为PCR产生的失误可能发生在该处。在207份标本中，有25%不止一个ITS型，可能是：(1)同一Pc基因在组中rDNA的不同拷贝(目前尚不知人型Pc的rDNA是否为多拷贝，但已证实大鼠型Pc的不少于2个拷贝^［13］)；(2)Pc的杂和体(假定Pc为二倍体有性生殖)；(3)标本采集和处理过程中的污染。对2份含6个ITS型的标本来说，很可能是污染所致，因为在一个被感染的宿主体内同时存在这么多同一种病原体的不同型是极罕见的。Hauser等^［8］用PCR/SSCP法检测了ITS1的多态性，在12份BAL标体中发现2个SSCP型，有7份标本含2个SSCP型，2个Pc株共同感染的可能性较大。Bartlett等^［14］用纤维素酯膜抽滤法从PcP患者家中及医院病房、走廊等不同环境的空气采集30份样本，PCR扩增后用型特异的寡核苷酸探针1-A、1-B、2-a、2-b和2-c打点杂交，其结果在17份(PCR阳性)来自患者病房空气的样本中有10份与相应患者BAL标本中Pc的ITS型完全一致，提示人与人之间或人与环境间Pc的空气传播是可能的。

2以线粒体rDNA分型

2.1mtLSUrDNA分型Latouche等^［15］用PCR扩增Pc的线粒体大亚基(mtLSU)rDNA的一个340bp片段后测序，在37份BAL标本中发现了3个与原型不同的基因型(由85、248和288位碱基的点突变所致)。作者又在18份BAL标本中发现与原型不同的4个变异型，其中有3份标本含2个变异型。由于在药物预防处理和未处理的患者间Pc均有变异，故没有理由认为药物处理导致了mtrDNA的改变^［6］。Tsolaki等^［10］也在死于PcP的6份肺组织标本中发现了85和248位碱基处的变异，还在一份标本的81位碱基处发现了新的变异(C→T)。Hauser等^［8］用PCR/SSCP法在12份BAL标本的mt26S基因(即mtLSUrDNA)中发现2个简单的SSCP型(1、3)和1个复合的SSCP型(1+2)。由于PCR测序法在测定靶基因扩增产物中少量等位基因(＜20%总基因量)时的敏感性不够，不能测出该等位基因的存在，因此在检测PCP第二病期或多个病期间是否发生基因型转换(genotype switching)时，必须使用一种更敏感的分型方法，即等位基因特异的PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)法，其敏感性比PCR测序法高200～2000倍。Keely等^［16］用该法(针对85位碱基设计2个等位基因特异的引物)检测采自5例AIDS患者在PcP不同病期及不同肺叶部位的12份BAL标本，结果只有1例患者在Ⅰ期PcP存在两个等位基因，没有证据显示采样部位或药物处理与基因型转换有关。Olsson等^［17］用PCR测序法及AS-PCR法(针对85位碱基设计3个等位基因特异的引物)发现在7例PcP患者BAL或痰液标本中，有1例存在2个测序型，某病房2份空气样本也存在2个测序型；有4例患者存在2或3个AS型，病房和走廊的13份空气样本中有9份也存在2个AS型；有4例患者的基因型(包括测序型和AS型)与相应病房空气中的基本符合，有2份走廊空气中的基因型也与各自患者及病房空气中的相符，仅有1例患者的基因型与其病房空气中的不一致。以上提示周围环境空气传播Pc的可能性，说明对高危PcP易感者的药物预防处理是必要的。虽然Pc的mtLSUrDNA只发现至多4个基因型，但它似乎是提供最可靠结果及检测共同感染存在的适宜靶基因；若结合ITS分型，能进行更准确的株鉴定^［6］。

2.2mtSSUrDNA分型Tsolaki等^［10］用PCR扩增Pc的线粒体小亚基(mtSSU)rDNA的一个300bp片段，克隆后测序，在3份肺组织标本中发现2个变异型：C₁₆₀／T₁₉₆和A₁₆₀／G₁₉₆，其中有1例患者存在2个变异型。

3以染色体其它基因分型

3.1TS基因分型TS基因是Pc的胸苷酸合成酶基因。Latouche等^［6］对13份阳性BAL标本用PCR测序法分析TS基因的279bp片段，未发现变异，与已报道的原型序列一致。由于TS基因是单拷贝的持家(housekeeping)基因，高度保守，故不适合用作PCR分型。

3.2arom基因分型arom基因是编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合成酶活性，与芳香族氨基酸生物合成有关的一个基因，在121位及208位碱基处具有多态性，存在不止一个基因型^［18］。Tsolaki等^［10］用PCR扩增该基因的一个237bp片段，克隆后测序，在3例患者的BAL标本中仅发现1个基因型：C₁₂₁／A₂₀₈。

3.3β-tub基因分型Hauser等^［8］用PCR/SSCP法分析β-微管蛋白第6内含子区(简称β-tub)的一个309bp片段，在12份BAL标本中发现2个SSCP型，其中有2份标本含2个SSCP型，可能存在共同感染。

综上所述，Pc的基因分型方法是建立在PCR基础上的。由于Pc的基因较保守，必须用很敏感的分型方法才能检测其有限的多态性。PCR测序法准确、可靠，且DNA测序仪能自动化操作，故该法是目前Pc常用的主要分型方法。但其敏感性不够高，操作条件苛刻且费用高，不利于大量样本及多个靶基因的分型。PCR/SSCP法能测出单个核苷酸突变所致的多态性，重复性好，相对简单，经济省时，较为实用。PCR探针杂交法分型能力有限。AS-PCR法虽敏感性极高，但操作繁琐且用途受限。在用于分型的靶基因中，以ITS的多态性较丰富，最适合Pc基因分型；其次是mtLSUrDNA，分型结果可靠。因为存在有的靶基因有变异时，其它的靶基因却无变异的现象；反之亦然。故仅用单一靶基因分型是不充分的，而仅用一种分型方法也是不全面的。实际工作中常常是多个靶基因或多种分型方法的联合应用^{6，8～10，17］}。目前，对Pc的研究还不理想，许多问题尚未最终解决，如Pc的自然源及其生存状况如何，是否具有感染性，患者是经自然环境感染还是被其他患者传染或是因幼年期潜伏感染，在PcP不同病期或几个PcP期是病原菌的复发感染还是同一株菌或新菌的再感染，多基因型的混合感染是不同Pc株还是Pc的杂和体或是同一株Pc某一基因的不同拷贝所致等，有待应用Pc的基因分型方法进一步深入系统地研究。

4参考文献

1.Bauer NL,et al.Immunologic comparisons in Pneumocystis carinii strains obtained from rats,ferrets and mice using convalescent sera from the same sources.J Protozool,1991,38:166.

2.Kovacs JA,et al Monoclonal ant