关键词： 鹦鹉热衣原体；兔繁殖障碍综合征

摘要本文报道一起暴发流行的兔繁殖障碍综合征，主要表现为子宫炎、流产、死胎、产弱仔和不孕等。经过鸡胚分离、感染McCoy细胞、特异性免疫荧光染色、姬姆萨染色观察包涵体、碘染色、磺胺抑制等试验，初步确认该病原为鹦鹉热衣原体。

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF CHLAMYDIA PSITTACI

FROM RABBITS WITH CHLAMYDIOSIS

Duan Qing Zhao Zhongli Tian Qing et al

(Institude of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071)

ABSTRACT One outbreak of Chlamydiosis in rabbits was investigated.Clinical findings were metritis,aborting,dead foetuses,premature nestlings.it infertility.The pathogen was isolated from liver and spleen of rabbits By.inoculating embryonated hen eggs,it was identified to be Chlamydia psittaci by experiments.

KEY WORDS Chlamydia psittaci Abnormal production in rabbits

鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）是人兽共患病病原体，也是国际《禁止生物武器公约》所列出的八种细菌战剂之一。

鹦鹉热衣原体的天然宿主是禽类和除人以外的哺乳动物，人在接触患病动物后可感染。动物感染一般出现生殖道和消化道症状，如流产、腹泻，以及结膜炎等。除禽类以外，已被病原学证实感染鹦鹉热衣原体的家畜有牛、羊、猪等，我国也均有报道。70年代以后，国外陆续发现兔群的鹦鹉热衣原体病，我国还未见报道。

1995年北京某年产2500只左右家兔的兔场出现大规模兔病，主要表现为繁殖障碍，母兔受孕率下降15％，流产率高，所产仔兔的离乳存活率下降近50％，临床可观察到的主要体征为体瘦，眼、口、鼻、外生殖器等部位炎症、溃烂、结痂，有白色粘稠分泌物，眼球水肿，角膜浑浊，卵巢及输卵管炎症等，有这些临床体症的病兔约占发病兔群的10％，另外约90％的病兔除表现繁殖障碍外，无其它临床体征。我们于1996年开始行病原分离和鉴定工作，在排除细菌、真菌、梅毒和弓形虫感染的同时，从鸡胚中分离出一株衣原体，经过一系列试验后初步鉴定为鹦鹉热衣原体。

1材料与方法

1.1接种鸡胚卵黄囊分离衣原体无菌操作采集有明显临床体征病兔的肝、脾标本，研磨后离心3000r/min取上清接种7日龄鸡胚卵黄囊，35℃孵育，逐日观察鸡胚发病情况，3日内死亡鸡胚弃去，未发病鸡胚孵至14d后活剖，取卵黄囊膜研磨后盲传2代；发病频死鸡胚采集卵黄囊膜压片，室温自然干燥后甲醇固定10min，用荧光标记的抗衣原体单克隆抗体（本实验室研制）染色37℃30min，于荧光显微镜油镜（×1000）下观察，查见有发亮绿色荧光的圆形颗粒（大小约为金黄色葡萄球菌1/4），则判断为衣原体感染阳性。阳性鸡胚感染材料研磨后冻存于液氮中以备随后试验。

1.2感染McCoy细胞将衣原体敏感的McCoy细胞接种放有盖玻片的24孔细胞培养板中，RPMI1640培养基（含小牛血清10％、链霉素50μg/ml、庆大霉素10μg/ml、制霉菌素25μg/ml）培养过夜，使细胞贴壁于盖玻片上长成单层，将卵黄囊膜感染材料接种单层细胞，0.3ml/孔，37℃3000r/min离心1h，孵育1h后换含0.5％葡萄糖上述培养液，培养24h后陆续取出盖玻片单层细胞，分别用姬姆萨和荧光标记抗衣原体单克隆抗体染色，于显微镜下观察包涵体。

1.3妊娠豚鼠感染试验中期孕(孕期40d左右）豚鼠4只，3只腹腔注射鸡胚感染材料，1ml/只，1只腹腔注射同剂量正常鸡胚卵黄囊膜研磨液，观察其流产和生产情况；采集新鲜流产胎儿肝、脾、肺组织，研磨后沉淀上清接种McCoy细胞，观察其包涵体形成情况；采集感染组和对照组豚鼠血清，检测抗衣原体抗体效价（方法同下，其中2抗为兔抗豚鼠荧光标记抗体，本实验室制备）。

1.4.1病兔抗衣原体抗体效价检测抗原片所用衣原体是1989年从输卵管浆液性囊肿病鸡体内分离的鸡株鹦鹉热衣原体^［1，2］。将鸡株衣原体接种McCoy细胞，48h后收集感染细胞，经3次冻融反复吹打，使细胞破裂释放衣原体，梯度离心分离衣原体颗粒，将纯化并浓缩的衣原体点在洁净玻片上，室温干燥后甲醇固定10min备用。

1.4.2抗体效价检测以微量免疫荧光法（Micro-IF）检测。收集病兔血清20份，其中有明显临床体征（眼、口、鼻、外生殖器炎症）者5份，将血清以无菌生理盐水1∶2、1：4、1∶8……对倍稀释，每一稀释度取20μl滴于抗原孔处，37℃湿盒孵育30min，PBS冲洗，晾干，滴加羊抗兔荧光标记抗体20μl，37℃湿盒反应30min，冲洗，滴加碱性甘油，于荧光显微镜油镜下观察，查见衣原体颗粒亮度达（++）以上的最高血清稀释度为该血清抗衣原体抗体效价。

1.5感染细胞碘染色和磺胺嘧啶抑制试验均按常规进行。

2结果与讨论

2.1病兔肝、脾、肺材料接种鸡胚7枚，3日内死亡3只弃之，另4枚第4天后鸡胚开始发暗，血管模糊不清，至第7天鸡胚重新透亮，血管恢复清晰，孵至第14天活剖，取卵黄囊膜研磨后盲传第2代，第4天后鸡胚陆续发病死亡，取卵黄囊膜压片在荧光显微镜下可见与抗衣原体荧光抗体反应、发亮绿色荧光的衣原体颗粒。随后卵黄囊膜感染材料连续3代接种鸡胚，均能引起鸡胚规律性死亡并查见衣原体颗粒。

2.2卵黄囊膜感染材料感染McCoy细胞，培养24h后分别用姬姆萨和荧光标记抗衣原体单克隆抗体染色，均能查见细胞内致密包涵体。

2.3在妊娠豚鼠感染试验中，3只感染豚鼠分别于感染后48h、第10天和第14天流产，流产胎儿的肝肺，组织中分离出衣原体，而对照组豚鼠正常分娩。感染组中3只豚鼠于感染后15d心脏采血（此时已全部流产），除一只采血不成功死亡外，其余2只抗衣原体抗体效价在Micro-IF中均为1∶512，正常组豚鼠抗体反应阴性。

2.4在病兔血清抗衣原体抗体效价检测中，有明显临床体征的5只病兔效价分别为1∶1024、1∶512、1∶32、1∶32、1∶32，无明显临床体征的15只病兔，除2只达1∶64以外，其余均低于1∶32。

2.5McCoy感染细胞姬姆萨和免疫荧光包涵体染色阳性，碘染色阴性。磺胺嘧啶钠1mg/只加感染材料共接种8枚鸡胚，接种4d后鸡胚陆续发病死亡，采集卵黄囊膜压片，染色均能查见衣原体。

以上研究试验证明，此次大规模家兔繁殖障碍疾病为兔衣原体病，病原为鹦鹉热衣原体。动物的繁殖障碍综合征表现为阴道炎、子宫炎、流产、死胎、产弱仔、不孕等。由鹦鹉热衣原体感染引起的兔繁殖障碍疾病以及对养兔业造成的损失国外已有报道^［3～6］，本研究证明我国也存在此种兔病，应该引起养兔业的重视。

参考文献

1.伍汝宣，等.当代畜牧.1993,1:16.

2.原丽等.动物检疫.1993,4:15.

3.Blanco Loizelier A.Revista del Patronato de Biologia Animal,1971,4:299.

4.Zampt IF.Journal of the South African Veterinary Association,1976,2:117.

5.M Julini et al.Rivista di Coniglicoltura,1985,6:29.

6.L Buratto et al.Cuniculture Paris,1991,101:253.

1998年4月收稿