关键词： 恶性疟原虫；复合重组抗原；单克隆抗体；抑制试验

摘要目的制备抗恶性疟原虫单克隆抗体，为疟疾诊断及疟疾疫苗等方面的研究提供良好的材料。方法以恶性疟原虫复合重组融合蛋白为免疫原，经细胞融合及ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。对其中3株2H12、3D5、4E5进行了染色体核型分析，对其分泌的单克隆抗体作SDS-PAGE、Western blot及Dot-ELISA鉴定，并初步观察了3株单抗对恶性疟原虫（海南分离株）的体外抑制作用。结果两次细胞融合共获得8株阳性克隆，其中3株即2H12、3D5、4E5的OD值超过阳性对照，传至20代以上经ELISA检测仍呈强阳性反应，将其腹腔接种给BALB/c小鼠获得血性腹水，抗体滴度为1∶12800。Western blot及Dot-ELISA分析显示3株单抗均与相应蛋白发生特异性反应。抑制试验结果表明：3株单抗对恶性疟原虫的体外生长和发育均有一定的抑制作用，抑制率分别为49％±3％、76％±6％、41％±2％。结论已获得稳定分泌抗恶性疟原虫复合重组抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

PRODUCTION AND IDENTIFICATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES

AGAINST HYBRID RECOMBINANT ANTIGENS OF PLASMODIUM

FALCIPARUM AND INHIBITORY TEST

Hao Wenbo¹Shen Jilong¹Yu Xinbing²et al

(Institute of Im munology,Bengbu Medical College,Bengbu 233003)

ABSTRACT Aim To obtain monoclonal antibodies against Plasmodium falciparum,which would provide useful help on further study in fast diagnosis and vaccine development of malaria.Methods In this subject,hybrid recombinant antigen of plasmodium falciparum was expressed as a fusion protein and acted as immunogen.After cell fusion,positive hybridoma cell lines were screened by ELISA.McAbs of 2H12,3D5 and 4E5 were indentified by SDS-PAGE,Western blot and Dot ELISA.Inhibitory effect of the three McAbs on the growth and development of P.falciparum in vitro was observed.Results Eight hybridoma cell lines were obtained after twice cell fusions,three lines with OD value higher than that of positive control exhibited strong positive reaction after 20 generations of incubation.Then,the three hybridoma cells were injected into BALB/c mice intraperitoneally,the bloody ascites were collected,the titer of which was up to 1∶12800.Western blot and Dot-ELISA analysis demonstrated that 2H12,3D5 and 4E5 all strongly and specifically reacted to the expressed 65kDa protein.The three McAbs were able to partially inhibit the growth and development of P.falciparum and the inhibitory rates were 49%±3%,76%±6%,and 41%±2% respectively.Conclusion The hybridoma cell lines which secreted stable monoclonal antibodies against hybrid recombinant antigen of Plasmodium falciparum have been obtained.

KEY WORDS Plasmodium falciparum hybrid recombinant antigen monoclonal antibody Inhibitory effect

疟疾是一类严重危害人类健康，流行范围很广的寄生虫病，其诊断及疫苗的研制是控制该病流行的重要环节。单克隆抗体技术问世以来，给疟疾的诊断、疟疾感染免疫的研究及疫苗的研制等提供了一种有效的手段，目前基因工程疫苗和人工合成疫苗的研制等都离不开以单抗作为筛选和鉴定的重要工具。国内外关于各种疟原虫子孢子、裂殖体、配子体等的单抗的研究已有多篇报道，本研究将徐劲^［1］等合成的恶性疟原虫复合基因PfCMR在大肠杆菌中高效表达，对表达产物分离、纯化后免疫BALB/c小鼠，制备McAb，以期获得针对多种抗原表位的功能不同的McAb，对抗体的特性进行了鉴定，并对其应用价值进行了初步探讨。

1材料和方法

1.1抗原的制备根据文献^［1，2］将含有恶性疟原虫复合基因PfCMR的工程菌pWR450-1/JM109在LB培养液中37℃振荡培养过夜，次日按1％比例扩增并用IPTG诱导后，收集菌体，再经超声破碎、透析、电泳纯化等步骤分离纯化表达的融合蛋白。

1.2BALB/c小鼠的免疫BALB/c小鼠由中山医科大学实验动物部提供，6～8周龄，体重18～20g，均为雄性。将纯化抗原加福氏完全佐剂1∶1混匀乳化后，皮内多点注射接种BALB/c小鼠，每只小鼠抗原接种剂量为5μg，卡介苗为1mg，间隔2周后以相同抗原剂量加福氏不完全佐剂皮下多点注射，以后每隔2周接种纯抗原，前后共接种4次，融合前3天再腹腔注射5μg纯化蛋白加强免疫。

1.3细胞融合^［3］末次免疫后3天，无菌取BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。融合剂为PEG4000（50％），脾细胞数量为1×10⁸个，骨髓瘤细胞数量为1～3×10⁷个。融合后细胞以HAT选择性培养液制成细胞悬液，加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔加0.1ml，然后将培养板置37℃、含5％CO₂的培养箱内培养。根据细胞生长情况每2～3天更换培养液一次，在融合后10天内用HAT培养液，10～17天换用HT培养液，17天后过渡为普通的完全RPMI-1640培养液。

1.4杂交瘤细胞的筛选及扩大培养^［3］细胞融合后约2周开始用ELISA方法对克隆长满1/3以上孔的培养上清进行检测，筛选抗原为纯化的表达融合蛋白。对反应阳性的各孔再用β-半乳糖苷酶包板进行检测，若为阳性则弃之，阴性保留，将其中3株表达产物反应阳性，β-半乳糖苷酶反应阴性的杂交瘤细胞用有限稀释法进行2～3次克隆化，至全部孔筛选均为阳性后传代扩大培养，并用动物体内诱生法大量制备McAb。

1.5单克隆抗体鉴定杂交瘤细胞的染色体分析^［3］，单克隆抗体的SDS-PAGE分析^［4］，Dot-ELISA^［5］，Western-blot^［4］，均按有关文献方法进行。

1.6体外抑制试验方法参见文献^［6］。

1.6.1恶性疟原虫的培养恶性疟原虫海南分离株由广东省药学院寄研室惠赠。恶性疟原虫复苏后用含8％红细胞的RPMI-1640完全培养液培养于37℃、5％CO₂的温箱中。

1.6.2恶性疟原虫的同步化处理待疟原虫密度达5％，且主要为环状体期时用5％甘露醇进行同步化处理。处理完毕后继续用含8％红细胞的RPMI-1640完全培养液进行培养。

1.6.3体外抑制试验在96孔细胞培养板上进行。选择32孔，每孔加入经同步化处理的含虫血100μl，再分别加入2H12、3D5、4E5 3株单抗的培养上清200μl（每株单抗加8孔，其中4孔为原浓度，4孔为培养基1∶10稀释），另4孔加空白质粒免疫鼠血清，4孔加RPMI1640完全培养液作为对照，混匀，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，每天换液一次。分别于1天、3天及5天后各孔取1滴血，涂片，吉姆萨染色后镜下检查5，000个红细胞，计算红细胞原虫感染率，观察恶性疟原虫繁殖情况及形态变化，对每3张片进行比较，并计算各株单抗对原虫生长的抑制率。

2结果

2.1复合基因PfCMR在大肠杆菌中的表达及纯化表达产物SDS-PAGE分析结果显示，经诱导后，PfCMR在分子量约为65kDa处有一条很浓的表达条带，与目的蛋白的理论分子量相符合。密度扫描显示融合蛋白产量占菌体蛋白总量的42.04％，纯化后的蛋白在65kDa的位置出现单一的显色条带。

2.2抗恶性疟原虫复合多价重组抗原单克隆抗体的制备本实验2次融合，经ELISA方法筛选共获得8株阳性杂交瘤细胞株，融合率和阳性率分别为81％和1.04％。其中5株克隆扩大培养后冻存，另3株（2H12、3D5、4E5）克隆OD值较高，超过阳性对照，分别进行克隆化培养，2H12经2次亚克隆，3D5、4E5经3次亚克隆后，再用ELISA方法进行筛选，100％孔均为阳性。再分别挑取单克隆孔进行扩大培养，每传2～3代用ELISA检测一次，至20代以上仍呈强阳性反应。将3株杂交瘤细胞（5×10⁵～10⁶）经腹腔接种给BALB/c小鼠，约2周后采集腹水，均呈血性，ELISA检测呈强阳性，抗体滴度为1∶12800。

2.3McAb的SDS-PAGE分析3株单抗腹水经SDS-PAGE分析均显示出一条主带，分子量约为40～45kDa。

2.4杂交瘤细胞的染色体分析2H12、3D5、4E5 3株杂交瘤细胞的染色体数目范围均在90～110之间，多数为端着丝点，可见少数标志染色体，见图1。

图12H12的染色体分析结果

2.5Dot-ELISA3株单抗（2H12、3D5、4