摘要目的表达伯氏疏螺旋体鞭毛蛋白特异性区段，探讨其作为诊断抗原的可行性。方法用PCR方法获取与其它种属螺旋体编码鞭毛蛋白的基因序列同源性较低的第409-786bp区段，经DNA序列测定证实后，经克隆、转化，在大肠杆菌BL₂₁(DE₃)中表达，并做Western-bolt分析。结果重组蛋白在宿主菌内表达高效、稳定，Western-blot示与抗鞭毛蛋白的单克隆抗体有较好的免疫反应性。结论以重组鞭毛蛋白的特异性区段作为诊断抗原具有可行性。

GENE CLONE AND EXPRESSION OF THE SPECIFIC FRAGMENT

OF FLAGELLIN FROM BORRELIA BURGDORFERI

Li XinjunZhang QienZhang PanheDai XiaohongZhang Xitan

(Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences Beijing 100850)

ABSTRACT Aim Expressing the specific fragment of flagellin from Borrelia burgdorferi,in order to evaluate the feasibility of this recombinant protein as a diagnostic antigen.Methods By using PCR method,to obtain the gene coding the Borrelia burgdorferi flagellin from 409bp to 786bp that exhibit low homology with related gene from other bacterial specise.Verified by DNA sequence detection,cloning and thansforming it was expressed in E.coli BL₂₁(DE₃)and evaluated by westernblot.Results The expressing of recombinant protein in host bacteria is effective and stable.Western-blot assay verified the immunological response to monoclone antidody to flagellin.Conclusion It showed the feasibility of recombinant protein as a diagnostic antigen.

KEY WORD Borrelia burgdorferi Flagellin Clone Expression.

莱姆病是一种多个器官系统受累的虫媒传染病。1982年，Burgdorferi等首先从莱姆病疫区的肩突硬蜱中分离出该病病原体，后被命名为伯氏疏螺旋体。现有的研究表明在不同宿主、地域分离的菌株其表型及遗传学特征均显示了较大的异源性，这不仅使莱姆病螺旋体的分类、鉴定变得较为复杂，也增加了实验诊断和免疫保护的难度。莱姆病螺旋体蛋白抗原因其可能在致病（毒力）和免疫保护反应中的重要作用而成为各国学者关注的焦点。分子生物学技术的应用使莱姆病螺旋体蛋白抗原基因及其产物的研究取得了积极进展。研究表明^［1］在莱姆病螺旋体众多的蛋白成分中，P100、P41（鞭毛蛋白）、OSPA、OSPC与其它种属菌的交叉反应性较小。鞭毛蛋白具有很强的免疫原性，可在感染后最早检测到其抗体，其编码基因位于染色体上，在传代中不易丢失，其异源性较质粒编码的外膜蛋白为小，经基因核苷酸序列和编码蛋白的氨基酸序列的比较^［2］发现莱姆病螺旋体鞭毛蛋白同梅毒螺旋体、大肠杆菌的鞭毛蛋白在N、C端有很高的同源性，而在中心区域则变异较大，该区域不与梅毒及正常人血清反应，提示可作为莱姆病早期血清学诊断的抗原标志。目前，诊断莱姆病的方法主要是病原体分离培养和血清学诊断，分离培养条件要求高、时间长，病人螺旋体血症持续时间短，故不利于早期诊断，常规采用ELISA和IFA测定血中特异性抗体IgM、IgG作为现症感染指标。近年来国外有较多报道用重组抗原代替全细胞抗原及纯化抗原，以简便经济快速特异地诊断莱姆病，但国内尚未见报道。我们以基因工程的方法获取了Bb鞭毛蛋白的特异性区段的重组“平截型蛋白”，为进一步探索以重组抗原为诊断抗原的血清学方法奠定了基础。

1材料与方法

1.1基因克隆、测序、表达所用的质粒和菌种克隆载体：pBluescriptⅡKS⁺（简称T-载体），表达载体：pET-17xb，受体菌：E.coli XL₁-Blue,E.coli.BL₂₁(DE₃)均有本所王海涛教授提供。

1.2工具酶、试剂溶菌酶、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoR I、T4DNA连接酶、RNaseA为Promega公司产品，dNTP、IPTG、X-Gal为华美公司产品，双链试剂盒为QIAGEN公司产品，³⁵S_-α dATP为DuPont公司产品，测序试剂盒T₇Sequencing Kit为USB产品。

1.3螺旋体菌株及培养伯氏疏螺旋体B31株Stanek惠赠，本室保存。培养条件：BSKⅡ型培养基，28℃，10～14d，暗视野下可见螺旋体呈簇状生长。

1.4螺旋体DNA的提取参照文献^［3］。

1.5引物设计根据已知的B31株编码鞭毛蛋白质的基因序列^［4］。设计一对引物。编码鞭毛蛋白的基因全长共1008bp，选取自第5′端409-428为引物1序列。第766-786为引物2序列，两引物5′端均加有限制性内切酶EcoRI识别的位点。由本所合成。

P1∶5′CGGAATTCATG⁴⁰⁹CAAACAAATCTGCTTCTCA⁴²⁸-3′

P2∶5′GCGAATTCTTA⁷⁸⁶ATCACTTATCATTCTAATAGC⁷⁶⁶—3′

1.6目的片段的扩增、纯化与回收

1.6.1PCR反应参数和反应体系参照文献^［2］

1.6.2琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物及目的片段的回收参照文献^［5］。

1.7目的片段的克隆

1.7.1连接将纯化的目的片段与经EcoRI消化的T载体用T₄DNA连接酶平端连接（片段与载体DNA之比为3～5∶1，反应体积15μl，15℃，12h）。

1.7.2感受态XL₁—Blue的制备及转化采用1×TSS转化法^［6］。

1.7.3菌落PCR鉴定随机挑取白色菌落传代培养，同时将一部分混入100μl纯水，煮沸5min，离心，上清液作为模板，进行PCR扩增鉴定。

1.7.4质粒酶切鉴定按QIAPrepSpin Plasmid Miniprep Kit(50)试剂盒说明书提取质粒并纯化^［5］，再经EcoRI切割（37℃，3h）2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

1.8目的片段重组表达质粒的构建将插有目的片段的T-载体经EcoRI单酶切，低熔点琼脂糖凝胶回收目的片段，插入经EcoRI酶切的pET-17xb中，转化XL₁-Blue受体菌，经菌落PCR、质粒酶切及DNA序列测定以鉴定阳性克隆。测序模板制备按QIAPrep Spin Plasmid Miniprep Kit(50)试剂盒说明书，测序反应参照文献^［5］。

1.9“平截型”鞭毛蛋白的表达和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

1.9.1pET-17xb重组质粒转化E.coli BL₂₁(DE₃)受体菌采用1×TSS转化法，同前。

1.9.2诱导采用化学诱导表达。转化的菌种接种LB液体培养基，经37℃、250r/min振摇至OD值为0.4、0.6、0.8时，加IPTG至终浓度为0.4mM/L，分别于1、2、3、4h收集菌液1ml，收集菌体。

1.9.3聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定参照文献^［5］。

1.10Westernblot分析用伯氏疏螺旋体VLG₂F₉-AF单克隆抗体作为一抗^［7］，以HRP-羊抗鼠IgG为二抗，步骤参照文献^［5］。

1.11包涵体的溶解参照文献^［5］。

1.12蛋白质的定量测定以BSA为标准，采用Bradford法。

2结果

2.1目的基因的扩增与鉴定PCR扩增出的基因片段，分子量大小约400bp，符合预期值（结果见图1）。将此片段克隆入T载体，经蓝/白斑、菌落PCR及质粒酶切鉴定，可筛出阳性克隆（酶切鉴定结果见图2）。

图1.Bp鞭毛蛋白编码基因的扩增结果

N：阴性对照1—4：1株扩增结果

M：PBR322/HinfIDNA分子量对照

Fig.1.PCR amplification of B31 flagellin gene.

N:Negative control.1-4:amplfied DNA from B31.

M:DNA molecular weight marker.

图2.重组T-载体的质粒酶切鉴定结果分析

1.原始PCR扩增产物对照2.阳性克隆的酶切结果

3.空白T-载体的酶切结果对照

Fig.2.The analgss of recombinant T-vector digested by EcoR I