关键词： CLL；E3区；序列分析；启动子

摘要对犬腺病毒Ⅰ型（CAV-Ⅰ）疫苗株CLL(Cannught Laboratory Limited)DNA的E3区，pVⅢ基因和部分fiber基因进行序列测定，E3区为病毒DNA复制非必需区，因而本实验结果对构建CLLE3缺失表达载体具有重要指导意义。

SEQUENCE ANALYSIS OF E3 REGION OF CANINE ADENOVIRUS

TYPE Ⅰ VACCINE STRAIN DNA

Li HaoWang ShuhuiZhang Yun

（Institute of Basic Medical Science,CAMS and PUMC,Beijing 100005）

ABSTRACTThe nucleotide sequence of the E3 region gene,pVⅢ gene and part of fiber gene of canine adenovirus type Ⅰ(CAV-Ⅰ)vaccine strain,CLL(Cannaught Laboratory Limited)was determined.The potential upstream promoter of E3 region was identified.This study will be useful for construction of CLL El-deleted expressive vector.

KEY WORDSCLLE3 regionSequence AnalysisPromoter

犬腺病毒Ⅰ型(CAV-Ⅰ)基因组为线性双链DNA，约为31kb，CAV-Ⅰ疫苗株CLL(Cannught Laboratory Limited)较CAV-Ⅰ更安全有效，其宿主范围广，以CLL构建成载体可制备基因工程疫苗防治动物或动物源性疾病，也可用于基因治疗^〔1，2〕。

本实验室已将CLL DNA 59m.u.-100m.u.克隆，在此基础上，为测序方便，我们又对部分E3区进行了亚克隆并参考有关文献^〔3，4〕，设计测序引物并采用通用引物，对CLL DNA E3区进行测序和分析，即验证本室对CLL DNA右末端克隆的正确性，又为构建E3区缺失载体打下基础。

1 材料和方法

1.1质粒pCLL59-100SN本实验室构建，将CLL DNA 59m.u.-100m.u.片段克隆进质粒pAT153中。

1.2质粒pCLL80-82SN将pCLL59-100SN以BamHI,NdeI双酶切（图1），把CLL DNA约80m.u.-82m.u.片段克隆进pUC18中。实验方法见文献^〔5〕。

1.3测序引物通用引物前设计引物1：5′-CCACAAATCAGAAGAACAAC-3′，根据已测序列设计引物2：5′-TTTATGAGAACTGCCACC-3′

1.4主要试剂本实验所用内切酶及连接酶均购自Promega公司。

1.5序列测定以双脱氧末端终止法进行，由医科院基础医学研究所国家重点实验室和北京赛百盛公司完成。

2 结果与讨论

人与动物腺病毒中，除羊腺病毒外，E3区都位于pVⅢ与fiber基因之间^〔6，7〕，CLL DNA经序列测定，E3区为811bp(693bp-1513bp)（图3），与其它动物腺病毒E3区大小相似，如猪腺病毒Ⅰ型和Ⅱ型分别为1162bp和1222bp^〔8〕，牛腺病毒Ⅲ型1.5kb^〔9〕，鼠腺病毒Ⅰ型为782bp^〔10〕，而较之人腺病毒E3区小的多，结构也简单的多。

从CLL DNA E3区结构（见图1）发现，其编码蛋白的开放阅读框（ORF）是相互重叠的。ORFⅠ与ORFⅡ间有14bp重叠，ORFⅢ与ORFⅡ,ORFⅢ与ORFⅣ间分别有26bp和89bp重叠。ORFⅠ编码的六邻体相关蛋白PVⅢ，ORFⅤ编码的N末端纤维蛋白Fiber均与病毒感染密切相关，为构建E3区缺失载体时不可缺少的部分。

图1CLL DNA E3区结构，显示相互重叠ORF,TATA box和polyA的位置

分析E3区上游启动子序列，TATA box及其上游GC box与CAAT box的模式，与有腺病毒和其它动物腺病毒相似。在起始位点上游，有许多转录因子结合位点，如：NF-kB、NF1、SP1和TFIID，如图2。许多文献已经证明^{〔11，12〕}，如这些结合位点发生缺失突变，将大大降低E3启动子的效率。与人腺病毒不同的是，在CLL E3区上游启动子序列中，没有发现ATF和AP1结合位点。

图2CLL DNA E3区启动子序列，起始位点上游有转录因子结合位点

CLL DNA E3区序列如图3。与已发表的CAV-Ⅰ^〔4〕序列相比，325bp缺失，4bp替换；与Compbell等未发表CLL序列相比，第946位A替换为C，从1531位开始的二个碱基GT替换为TG。另外，在ORFV前，发现E3区有两个polyA信号，相距只有22bp，具体功能尚不清楚。

本实验通过对E3区序列测定，首次分析了其上游启动子结构。目前，对动物腺病毒的研究已成为热点，除了在防治动物或动物源性疾病起重要作用外，动物腺病毒作为基因转移载体，能克服人腺病毒载体的许多缺点。本实验结果，对构建CLL表达载体具有重要的指导意义和参考价值。

图3CLL DNA E3区序列

（感谢加拿大多伦多大学微生物学系JB.Compbell教授提供细胞、毒种及对本课题的支持。）

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收稿日期：1998年9月3日