关键词： BAC细胞；TGFβ1；ACTH受体；Scatchard分析

摘要目的观察牛肾上腺皮质细胞ACTH受体的分布和转化生长因子β1(TGFβ1)对ACTH受体的调节作用。方法牛肾上腺皮质束、网带细胞（BAC细胞）的原代培养和¹²⁵I-ACTH特异性受体结合标记等。结果在该培养条件下，BAC细胞的受体可分为高、低两种亲和力亚型。它们在每个细胞上的数目分别为3400（高）和15000（低）个。kD分别为4.90368×10^-11和3.53974×10^-10mol/L。TGFβ1可减少高亲和力受体至2000个，增加低亲和力受体到33000个。它们的kD也相应地发生了改变。结论TGFβ1对受体亚型具有不同的调节作用，TGFβ1对ACTH高亲和力受体的负性调节作用和ACTH对TGFβ1受体的正性调节作用可能构成对肾上腺皮质激素生成活动调节的负反馈机制。

BOVING ACTH-RECEPTORS AND REGULATION OF TGFβ1

Jiang ZhiwenXia JunYu YuminWu HuabuChen GualiangTao Minfei

(Department of Pharmacology,Bengbu Medical College,Bengbu,233003)

ABSTRACTAim To observe the distributions of ACTH-receptors on bovine adrenocortical cells and the action of transforming growth factor β1(TGFβ1) on ACTH-recptors.Method Primary culture of bovine adrenocortical fascilata-reticularis cell and ¹²⁵I-ACTH specific receptor binding labeling.Results Under this culture condition,ACTH-receptors could be divided into two types(high affinity and low affinity).Their numbers were 3400 sites/cell for high affinity and 15000 sites/cell for low affinity.Their equilibrium dissociation constants(kD) were 4.90368×10^-11 and 3.53974×10^-10mol/L respectively.TGFβ1 treatment decreased high affinity receptors to 2000 sites/cell and increased low affinity receptors to 33000 sites/cell.Their kDs were changed correspondingly.Conclusion TGFβ1 expressed different effects on ACTH high and low affinity receptors.Down regulation of TGFβ1 on high affinity ACTH-receptors as well as Up regulation ACTH on TGFβ1-receptors maybe constitute a negative feedback mechanism by which the steroidogenesis of BAC cells is controlled.

KEY WORDSBAC cell TGFβ1 ACTH-receptor Scatchard analysis

ACTH不仅对肾上腺皮质细胞合成皮质激素具有强大的刺激作用，还可通过ACTH-硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)-成纤维细胞生长因子(FGF)这一间接环路调节BAC细胞的增殖活动^〔1〕。作为BAC细胞的自分泌因子-TGFβ1^〔2〕，其不但在BAC细胞上含量丰富^〔3〕，而且可通过与BAC细胞上的TGFβ1受体的结合^〔4〕调节BAC细胞生物活动^〔5，6〕。TGFβ1和ACTH这一对激素、因子受体在BAC细胞上密切的彼邻关系以及它们对BAC细胞的共同作用^〔7，8〕，强烈提示它们之间也可能存在着交互作用。Cochet^〔4〕等人曾报道了ACTH能增加BAC细胞的TGFβ1受体数目的单方面作用，本文则继之探讨TGFβ1对ACTH受体的影响。

1材料和方法

1.1材料纯化人血小板TGFβ1(R&D system)由J-J Feige博士惠赠。Trition X-100、胰酶、明胶(Sigma),MEM(Life Techonologies,U.S.A),¹²⁵I-ACTH(45621 Gbqmmol^-1和76254 Gbqmmol^-1（美国德普公司）,HEPES（华美公司），新生牛血清（浙江三利生物制品厂），其他试剂均系市售优级纯。

1.2BAC细胞培养取当地新鲜黄牛肾上腺，制备束、网状带分散细胞，按5×10⁴细胞／孔的密度接种到24孔培养板中（每孔加MEM 1ml含新生牛血清10％，青霉素100u，庆大霉素50u），在5％CO₂和37℃湿温下培养，每天换液一次，第6d细胞生长接近融合状态。

¹²⁵I-ACTH-受体饱和结合时间测定吸弃细胞培养基（MEM），加含明胶（0.15％）的无血清的MEM，继续培养2h。取出培养板，吸弃培养液，用冷PBS洗单层细胞2次，吸弃PBS。每孔加含25mmol HEPES,0.15%明胶的¹²⁵I-ACTH(2.45×10⁵ cpm),4℃分别结合40,80,120,180min（连续摇晃）。结合末，移去结合液，冷PBS洗细胞2次，每孔加提取液0.5ml(0.5% Triton X-100,0.1mol磷酸钠pH8.1),4℃提取10min，搔刮、收集细胞，以冷PBS冲洗各孔，将细胞液和冲洗液合并为B,γ-计数仪（计数效率70％）检测各管放射活性。

¹²⁵I-ACTH-受体结合测定方法基本同上。处理组加TGFβ1 2ng/ml，刺激24h。标记液所含¹²⁵I-ACTH的为所需cpm的系列浓度。结合时间为2h。标记末，收集各孔内放射活性标记培养基，用冷PBS冲洗细胞2次，合并收集液和洗液为F。加入提取液，10min后搔刮、收集细胞，以冷PBS冲洗各孔，合并细胞液和洗液为B。γ-计数仪检测放射活性。

每个cpm浓度的¹²⁵I-ACTH受体结合实验均设置复管，并重复之。Scatchard法分析受体数目。

2结果

BAC细胞的培养按5×10⁵细胞密度/孔接种后，细胞在24h内贴壁，并继之表现为成纤维细胞状，每日换液一次，培养至第6d，镜下见细胞生长呈近融合状态。

¹²⁵I-ACTH-受体达饱和性结合的时间在5×10⁵细胞/孔中加入2.45×10⁵cpm的¹²⁵I-ACTH，约在2h时结合达到饱和（图1）。

图1¹²⁵I-ACTH受体饱和结合测定

Fig 1 Determination of ¹²⁵I-ACTH receptor saturation binding

TGFβ1对ACTH受体的影响对照组和TGFβ1处理组的¹²⁵I-ACTH-受体的Scatchard曲线均清楚地表现为高、低亲和力两个亚型。对照组的高亲和力受体为3400个/细胞，kD=4.90368×10^-11mol/L，低亲和力受体为15000个/细胞，kD=3.53974×10^-10。接受2ng/ml的TGFβ1刺激24h后，ACTH高亲和力受体减少到2000个/细胞，kD增至1.34755×10^-11mol/L；低亲和力受体增加到33000个/细胞，kD减至1.11729×10^-9mol/L（图2a,b）。

图2BAC细胞¹²⁵I-ACTH受体结合的Scatchard分析a、对照b、TGFβ1-处理

Fig 2 Scatchard analysis of ¹²⁵I-ACTH receptors binding of BAC cella、controlb、TGFβ1 treatmentr

3讨论

肾上腺皮质细胞同时分布有ACTH和TGFβ1的受体，为这一对激素、因子之间的交互作用提供了分子生化学基础。事实上这一对激素、因子对肾上腺皮质细胞的活动多表现为交叉性的影响，如ACTH对肾上腺皮质细胞合成皮质激素具有强大的刺激作用，而TGFβ1对基础的和由ACTH刺激的皮质激素的合成均表现为显著的抑制作用；且二者均可刺激肾上腺皮质细胞合成HSPG，增加HSPG同bFGF的结合，不同的是ACTH更突出地表现为对HSPG的分泌和降解，对结合的bFGF的游离和释放的强大刺激作用。这种交互作用的是如何实现的？Cochet^〔4〕等人曾发现ACTH能增加BAC细胞TGFβ1受体数目，从单方面展示了这一对激素、因子的相互作用。Perrin^〔7〕等人虽证实了TGFβ1能抑制甾体17α羟化酶，但这似仅能说明：TGFβ1直接抑制该酶的活性或者TGFβ1拮抗了ACTH对该酶的刺激作用，并未能对何以发挥抑制作用作出解释。本实验利用BAC细胞原代培养和特异性¹²⁵I-ACTH配基受体亲和标记技术证明：TGFβ1可使培养的BAC细胞的ACTH高亲和力受体数目减少，提示TGFβ1的这种作用可能与其对肾上腺皮质激素生成的抑制作用有关。综合Cochet、Perrin的报道和本实验结果似可得出这样一个假说，即：在肾上腺皮质激素的合成调节中存在着一个由TGFβ1-ACTH构成的负反馈调节环路。当ACTH与其受体结合，刺激肾上腺皮质激素的合成的同时也使得TGFβ1受体数目增加，后者通过与TGFβ1的作用，使ACTH高亲和力受体的数量减少，进而使肾上腺皮质激素的合成的同时也使得TGFβ1受体数目增加，后者通过与TGFβ1的作用，使ACTH高亲和力受体的数量减少，进而使肾上腺皮质激素的生成保持动态平衡，使内环境趋于稳定。本结合中TGFβ1对ACTH低亲和力受体数目的增加作用，很可能与其增加蛋白多糖的合成作用^〔1〕有关，因为TGFβ1对肾上腺皮质细胞的合成具有强大的刺激作用，当然这种ACTH低亲和力受体的本质以及TGFβ1增加ACTH低亲和力受体数目的意义尚须进一