弓形虫是人类重要的机会性致病原虫，人类和多种脊椎动物都可以作为其中间宿主，它不仅对畜牧业的发展造成很大的影响，更对人类造成严重危害。弓形虫所致后天感染虽然在免疫力正常的宿主只引起轻微疾病，但是由于各种原因宿主免疫力下降时，隐性感染再燃，诱发严重的弓形虫脑炎。这是AIDS患者重要死因之一。血清流行病学调查发现，弓形虫感染高阳性地区的AIDS患者发生弓形虫脑炎者达48％^〔1〕。弓形虫通过母婴传播造成先天性感染，引起胎儿流产、死胎或畸形。因此，弓形虫和弓形虫病的基础性研究在国内外受到一定重视，并开展了一系列工作。随着分子生物学的进展，许多学者对弓形虫进行了这方面的工作。本文仅就弓形虫速殖子与缓殖子的阶段特异蛋白表达的分子生物学，以及虫株毒力与基因（型）关系的研究近况做一介绍。

1弓形虫基因组的特点

弓形虫的生活史中除了合子时期之外，其他时期其核均为单倍体。已确定的染色体有8条，染色体DNA大小从2Mb至＞6Mb范围。各编号染色体大小为：Ⅰ.2.0Mb；Ⅱ.2.4Mb；Ⅲ.2.6Mb；Ⅳ.3.0Mb；Ⅴ.3.7Mb；Ⅵ.4.1Mb；Ⅶ.4.5Mb；Ⅷ.6.0Mb。不同分离株的一些相应染色体大小变异约15％^〔2，3〕。DNA的鸟嘌呤和胞嘧啶（G+C）含量约50％^〔4〕。线粒体DNA环状为36kb，有1个10kb的反向重复顺序^〔5〕。P30、α和β-微管蛋白、P24基因的转录起始位点的上游区域已经确定^〔6～8〕。但是没有发现高等真核细胞所共有的启动子元件如TATA和CCAAT盒。只有编码P24的基因具有1个CAAT盒^〔7〕。弓形虫的基因组相对较小，约为9×10⁷bp，由于弓形虫表达的蛋白很少大于100kDa，且已知基因多缺内含子，从而推测弓形虫的基因数在20000个范围之内^〔9〕。

2弓形虫速殖子特异性蛋白基因

弓形虫速殖子至少含1000种以上的蛋白质，但虫体表面主要蛋白只有5～7种，分子量范围在14～60kDa之间，最主要者为30kDa（P30），它约占虫体总蛋白量的3％^〔2〕。由于速殖子在小鼠体内及体外容易获得，便于对其进行研究，因此速殖子特异蛋白基因的研究要早于缓殖子，其中编码速殖子特异蛋白P30^〔6〕、P21^〔10〕、P22^〔11〕、P28^〔12〕等的基因都已有报告。其中，编码P30的SAG1基因研究比较全面，对基因表达的调节也有一定了解。目前，在研究弓形虫速殖子-缓殖子转化工作中，由于缓殖子不表达P30（SAG1），故常将其作为速殖子的标志。SAG1转录起始位点在5'侧翼区上游70bp处的5个完整27bp的串联重复序列，这些重复序列构成两条DNA链上的开读框架（ORF）^〔6〕，它可能对基因表达转录水平的调节起重要作用。毒力株有5个27bp重复顺序，非毒力株只有4个，RT-PCR发现毒力株SAG1表达比非毒力株至少要高4倍^〔13〕。SAG1翻译起始位点是从第二个蛋氨酸密码开始，而不是第一个。这与真核细胞共有序列翻译的起始点是一致的，并且与α、β-微管蛋白的翻译起始位点相同。SAG1基因是单拷贝，其mRNA长约1500核苷酸（nt），虫体的mRNA含量很高，至少占RNA总量的0.1％。该基因初始翻译产物为34.7kDa具有一个疏水尾的多肽，但天然蛋白其尾部是糖磷脂锚，这说明SAG1蛋白有一个翻译后剪切的修饰^〔6〕。

3缓殖子特异蛋白基因及其表达调节

由于弓形虫缓殖子可以活化成为速殖子，导致严重的弓形虫脑炎，所以缓殖子-速殖子的转化问题也就成为近几年研究的热点。虽然速殖子在体外培养中可自发地转化为缓殖子而形成包囊，但某些因素（如碱性pH值、NO或线粒体呼吸链的抑制剂以及添加宿主细胞等）似可导致虫体复制速率下降，同时诱发缓殖子特异蛋白的表达^{〔14～19〕}。但是缓殖子与速殖子转化的分子生物学机制仍不清楚。目前许多学者从研究缓殖子的特异蛋白基因入手，通过追踪转化过程中缓殖子特异基因的表达，进而研究缓殖子-速殖子转化的遗传机制。随着体外培养弓形虫包囊的成功以及转染技术的发展，都为缓殖子特异基因的深入研究提供了必要条件。可以预见，从转录水平阐明弓形虫速殖子-缓殖子转化的机制，有望达到从分子水平阻碍包囊的形成与活化，这必将成为弓形虫病治疗的一个突破。到目前为止，研究的缓殖子特异表达的基因分别为编码包囊基质、缓殖子膜与胞浆特异抗原的基因。

3.1编码包囊基质65kDa特异蛋白的MAG1基因Parmley等^〔9〕用缓殖子特异多克隆抗体从构建的缓殖子cDNA文库中筛选出的50个克隆，其cDNA片段从200-2000bp不等，其中两个不互相重叠的克隆为携带1.2kb插入子的B3.7和携带0.8kb插入子的B1.14。由B3.7菌斑亲和纯化慢性感染小鼠血清抗体，仅在包囊溶解物中检出分子量为65kDa的蛋白，而在速殖子不能检测到。免疫电镜显示65kDa蛋白主要位于包囊基质，其次是囊壁，而速殖子纳虫泡内缺如。这一表达包囊基质65kDa成分的基因命名为MAG1，其表达的65kDa蛋白命名为MAG1。完整的MAG1基因包含2875bp；B3.7和B1.14有相同的ORF。从803位ATG开始的初始翻译产物含452个氨基酸，理论上分子量为49135Da。MAG1基因有两个内含子，这与弓形虫大部分基因没有内含子是不同的。一个内含子为503bp，位于803位ATG上游4个bp，这种位于5’不翻译区（5’-UTR）的内含子是很少见的，因为大多数内含子位于蛋白编码区。这个内含子可能与蛋白表达调节有关。另外，ATG上游的-3位A残基在弓形虫其它基因中也有发现^{〔6～10，20～23〕}。另一个内含子为110bp，位于第1个ATG下游95bp处，位于2775位的polyA下游47bp处有一个功能不十分清楚的13个nt的聚嘧啶序列，它与锥虫的多顺反子转录相似，由于后者参与反式剪接的偶联和聚腺苷酸化，形成加工的mRNA，对蛋白表达有直接作用，所以推测MAG1基因中的聚嘧啶序列在蛋白表达调节上可能有类似作用。MAG1基因编码的蛋白在氨基末端含有一个25残基的信号肽，这与天然蛋白位置相同。免疫印渍和免疫荧光都发现兔抗MAG1血清只与包囊溶解物中65kDa分子反应，不与速殖子反应。

3.2编码缓殖子特异18kDa表面抗原的SAG4基因Tomavo等^〔24〕曾确定了4种缓殖子特异表面抗原（P36、34、21、18kDa），其后，Odberg-Ferragut^〔25〕等通过自行设计的探针克隆了编码缓殖子特异表面抗原18kDa蛋白的基因，核苷酸序列分析显示一个516nt的长ORF，ATG密码子是其起始位点，有一个框内终止密码子位于起始密码子之前。SAG4编码172氨基酸的蛋白，理论上分子量为18.5kDa，与天然蛋白完全匹配。该基因定名为SAG4，其产物名为SAG4。SAG4的N端疏水区有一个27氨基酸的信号肽，C端疏水区有一个糖磷脂锚（GP1）信号，这与P18是以糖磷脂锚定在细胞膜上是一致的。SAG4无内含子。为单拷贝基因。虽然5’端没有典型的TATA或CCAAT同感启动子顺序，而六聚体ACGCCG在5’端出现3次，这在缓殖子其它特异基因中是没有的^{〔9，27～29〕}。终止信号下游709bp处的poly A位点没有高等真核生物在poly A尾上游30nt处的poly A信号AAUAAA。PLK（无毒力株）和RH株的SAG4启动子区域非常相似，说明启动子区域可能并不能调节缓殖子转化。在另两个缓殖子基因MAG1和hsp/BAG1中发现的TGCTGTGTC序列^〔9，26〕，于SAG4基因中并没发现，似说明这个启动子顺序可能也不是缓殖子特异的。

3.3编码缓殖子特异的胞浆抗原的基因

3.3.1编码缓殖子胞浆抗原BAG5的基因Parmley等^〔27〕从构建的缓殖子cDNA文库中用Mab74.18筛选并克隆的基因BAG5为1238bp，ORF编码229个氨基酸，推测的分子量为25kDa，其两个区域与2种已知蛋白有明显的同源性，N端50氨基酸区域与人突触蛋白（Synapsin）la的B区同源。突触蛋白是外周神经膜蛋白，具有将突触泡结合在细胞骨架的功能，虽然这种同源的意义并不十分清楚，但是因为BAG5编码蛋白位于缓殖子胞浆，所以该区域可能参与细胞骨架的连接或其它蛋白与蛋白之间的相互作用；C端55氨基酸区域与植物的小热休克蛋白（sHSP)具有明显的同源性，这个区域可能是一个保守的结合区，对蛋白之间的相互作用有协调作用。P28可能作为热休克蛋白与由刺激因素诸如碱性pH诱导其表达的作用是一致的。此外，热休克蛋白还能诱导其它缓殖子特异蛋白的表达^〔15〕。RT-PCR显示BAG5基因表达调节主要在转录水平。

3.3.2编码缓殖子胞浆特异多肽（LDH）的基因Yang^〔28〕从缓殖子cDNA文库中筛选出的Tgb9插入子，该基因为2593nt，有一长的ORF（978nt）编码326个氨基酸，在5’端有一个268nt的UTR及3’端的1347nt的UTR。缓殖子特异多肽分子量为35kDa，等电点为7.08。RT-PCR显示其只在缓殖子表达，说明其调节也是在转录水平。Tgb9编码的多肽与乳酸脱氢酶（LDH）氨基酸顺序有同一性，与恶性疟原虫LDH的相同率为60.1％。LDH的一些重要氨基酸残基在Tgb9编码的多肽中也存在。因为LDH是催化乳酸和丙酮酸之间互相转化的糖酵解酶，所以推测，这个缓殖子特异的LDH可能在其能量代谢中有关键的作用。进一步研究其与速殖子LDH不同，可以加深对缓殖子的转化机制的认识。

3.3.3编码缓殖子胞浆特异蛋白的BAG1基因编码缓殖子特异的30kDa胞浆蛋白，这一蛋白与植物的sHSP具有同一性。RT-PCR显示其只在缓殖子被扩增表达，说明与其它缓殖子特异蛋白一<