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摘要目的对弓形虫人源性RH株、人源性ZS2株、猪源性CN株3个不同地理株的GRA1基因片段鉴定并比较异同。方法采用PCR技术和限制性内切酶技术，分别对弓形虫3株的GRA1基因片段进行体外扩增。扩增的目的基因片段分别用3种内切酶HindⅢ、HpaⅡ、TaqⅠ进行单酶切鉴定、比较。结果从弓形虫3个分离株RH株、ZS2株、CN株基因组DNA中扩增出785bp的GRA1基因片段。3个株的GRA1基因分别用3种内切酶酶切后，酶切片段与理论值相符。结论实验所用不同来源弓形虫分离株的GRA1基因扩增片段基本相同，且3种限制性内切酶酶切图谱基本一致，表明这3个分离株的GRA1基因高度保守。
COMPARISON OF GRA1 GENE AMPLIFIED IN VITRO FROM DIFFERENT
GEOGRAPHICAL AND HETEROLOGOUS TOXOPLASMA GONDII ISOLATES
Jia XuemeiGuo HongChen GuanjinZheng Huanqin
(Institute of Parasitology,Sun Yat-Sen University of Medical Science,Guangzhou 510089)
ABSTRACTAimComparison of amplification of GRA1 gene in vitro from different geographical and heterologous Toxoplasma gondii isolates RH(human),ZS2(human),CN(pig) in study.Methods Using polymerase chain reaction(PCR) and restriction analysis techniques,the specific fragments of GRA1 gene were amplified from the genomic DNA of Toxoplasma gondii RH,ZS2,CN isolates.The fragments of GRA1 gene were digested by HindⅢ,HpaⅡ,TaqⅠ in the restriction endonuclease reaction,which had been identified in agarose gel electrophorosis.Results The specific fragments of GRA1 gene were successfully amplified from the genomic DNA of RH isolate,CN isolate,ZS2 isolate of Toxoplasma gondii.The fragments of PCR amplification digested with HindⅢ,HpaⅡ,TaqⅠ were not significantly different.Conclusion It demonstracted highly conservation among heterologous Toxoplasma isolates GRA1 genes.
KEY WORDSToxoplasma gondiiGRA1 genePolymerase chain reactionRestriction endonuclease reaction
弓形虫(Toxoplasma gondii)作为一种重要的机会性致病原虫，已经越来越引起人们的关注和重视〔1〕。致密颗粒抗原是弓形虫的分泌排泄抗原之一，由弓形虫侵入宿主细胞后从其致密颗粒(Dense granule organelles)释放入纳虫泡。致密颗粒蛋白已知的至少有7种〔2〕。1989年，Cesbron-Delauw等首次报道了致密颗粒蛋白GRA1基因的分子生物学特性〔3〕，认为该抗原可能具有用于弓形虫慢性及隐性感染的诊断和作为候选疫苗的潜在价值。
目前认为全球分布的刚地弓形虫是弓形虫属唯一的一个种。但已在世界各地的不同宿主组织中分离到许多虫株〔4〕。它们在形态学上并不一定差异明显，但对宿主的感染、药敏等生物学特性方面存在着某些不同。对弓形虫非同源性不同地理株GRA1基因的比较研究报道不多。本文选择了RH株（人源）、ZS2株（人源）、CN株（猪源）3个鼠强毒株，其中ZS2株为本室分离株、CN株为常宁市分离株，应用PCR技术和酶切技术，对这3个不同来源分离株的GRA1 基因片段进行了体外扩增及酶切鉴定，以比较虫株间的差异。为弓形虫不同虫株GRA1基因的克隆、重组等基础研究和进一步的应用研究奠定了基础。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1弓形虫株国际标准株RH株（人源），ZS2株（人源）、CN株（猪源）。均为本室传代保种。
1.1.2动物昆明远交系小白鼠，雌雄并用，体重20±2g，复苏接种虫株用。
1.1.3主要试剂PCR扩增试剂盒为加拿大真达公司产品；蛋白酶K为Sigma公司产品；HindⅢ和HpaⅡ购自华美生物工程公司；TaqⅠ为MBI产品；其它常规试剂为国产分析纯。
1.1.4主要仪器PCR扩增仪为珠海HAMA-480
1.2方法
1.2.1引物的设计合成根据已知的弓形虫GRA1基因序列〔3〕，自行设计一对引物（P1、P2）。P1：5′-CTTGAATTCATGATCGGTTGAAACTGC3′，共27个碱基。其中GAATTC为限制性内切酶EcoRI酶切位点。P2：5′-CTCGGATCCTTATGT-TAGGAACCCAAT3′，共27个碱基，其中GGATCC为限制性内切酶BamHⅠ酶切位点。经计算机PCR引物设计软件分析，由上海生工生物工程公司合成。
1.2.2酶谱分析经计算机PCGENE软件对限制性内切酶位点分析，目的基因GRA1片段中，HindⅢ酶切位点一个，位于469bp处；HpaⅡ的酶切位点两个，分别位于274bp和444bp处。TaqⅠ的酶切位点4个，分别位于105bp、309bp、604bp、709bp处。
1.2.3弓形虫RH株、ZS2株、CN株基因组DNA的提取复苏液氮保存的弓形虫RH、ZS2、CN分离株，分别腹腔接种于小鼠，传代1次，于3天后收取腹水，NS洗涤腹腔3次，离心收集速殖子。按文献〔5〕，加融虫液和蛋白酶K，置37℃水浴消化，过夜后，用饱和酚/氯仿、异戊醇（按25∶24∶1混合）抽提2次，加1/10体积NaAc及2.5倍体积冰冻无水乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤1次，挥发干，加30μl TE溶解DNA。加RNase后分装，-20℃保存，备用。
1.2.4RH株、ZS2株、CN株GRA1基因片段的扩增以所抽提的RH株、ZS2株、CN株的基因组DNA为模板，在0.5ml Eppendorf管中，顺序加入ddH2O、buffer、dNTP、引物P1和P2、模板DNA，反应总体积为50μl。反应条件为：96℃预变性6min后，加入1μl TaqE，混匀，稍离心，加入石蜡油，94℃变性45sec;55℃退火45sec；72℃延伸90sec；共30个循环。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.2.5RH株、ZS2株、CN株GRA1基因片段的扩增产物酶切鉴定
1.2.5.13株PCR产物的HindⅢ酶切鉴定将RH株、ZS2株、CN株的PCR产物去石蜡油，乙醇沉淀后，溶于ddH2O中。在0.5mlEp管中，顺序加入ddH2O、E buffer、HindⅢ、PCR产物。反应条件为：37℃水浴2h。分别酶切。反应产物用标准分子量marker经电泳鉴定、比较。
1.2.5.23株PCR产物的HpaⅡ酶切鉴定将RH株、ZS2株、CN株的PCR产物去石蜡油，乙醇沉淀后，溶于ddH2O中。在0.5ml Ep管中，顺序加入ddH2O、A buffer、HpaⅡ、PCR产物。反应条件同1.2.5.1。分别酶切。反应产物用标准分子量marker经电泳鉴定、比较。
1.2.5.33株PCR产物的TaqⅠ酶切鉴定将RH株、ZS2株、CN株的PCR产物去石蜡油，乙醇沉淀后，溶于ddH2O中。在0.5ml Ep管中，顺序加入ddH2O、buffer、TaqⅠ、PCR产物，反应终浓度加入0.5mg/mlBSA。反应条件为65℃水浴1h。分别酶切。反应产物用标准分子量marker经电泳鉴定、比较。
2结果
2.1RH株、ZS2株、CN株GRA1基因片段的扩增本文设计并合成一对引物P1、P2，在前述PCR反应条件下，从RH株、ZS2株、CN株基因组DNA中特异地扩增出GRA1基因片段。结果如图1所示，特异扩增带经1.2%琼脂糖凝胶电泳，位置在PCR标准的第2、3两条带之间，其大小与理论值相符,约785bp。
图1RH株、ZS2株、CN株GRA1基因片段的扩增产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳图谱
1.PCR分子量标准2.RH株GRA1扩增片段3.ZS2株GRA1扩增片段4.CN株GRA1扩增片段
Fig.1 Fragments of PCR amplification
1.PCR Markers 2.RH isolate 3.ZS2 isolate 4.CN isolate
2.2弓形虫RH株、ZS2株、CN株扩增产物的HindⅢ酶切鉴定GRA1基因的酶谱分析表明，HindⅢ位点在469bp处，该酶切GRA1后应该有469bp和316bp两个片段。弓形虫RH株、ZS2株、CN株扩增产物经HindⅢ酶切后，1.2%琼脂糖凝胶电泳，在PCR标准的第4、5条带和第5、6条带之间分别有两个酶切产物条带出现，其大小与预期值相符。3个分离株无明显区别（图2）。
