弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，所致弓形虫病多见于胎儿和免疫力低下的人群。由于弓形虫感染是导致先天性畸形的主要原因之一，还由于不少艾滋病患者和肿瘤病人死于弓形虫性脑炎，更由于弓形虫可侵犯人体各个器官系统，所致病症涉及临床各科。本文简要介绍弓形虫基因研究与应用方面的最新进展。

1弓形虫的基因研究

1.1染色体与分子核型弓形虫生活史有无性繁殖与有性生殖两个世代。除有性生殖期间及无性二分裂之前的虫体外，弓形虫的核是单倍体型的。单倍体核含染色体数目尚未完全弄清，经脉冲电场凝胶电泳确定的染色体有8条，估计总数不超过12条，分子量范围在2至10Mbp以上，弓形虫各分离株之间染色体分子量大小变异在20％以下。单倍体核DNA大约含8×10⁷bp。其GC含量约为55％，未发现在基因调节中起重要作用的甲基化碱基。据报道，弓形虫线粒体DNA呈环状，长约36kb，并且有一个10kb的反向重复序列^〔1〕。

1.2克隆的几种基因及其产物

1.2.1表膜抗原基因现在已知弓形虫速殖子有5种主要表膜蛋白，根据分子量大小分别谓之P22、P23、P30、P35及P43，均藉糖化磷脂酰肌醇锚锭在表膜上^〔2〕。其中编码P30、P22、P43基因已有研究报道，基因代号由前至后分别为SAG1、SAG2及SAG3。

SAG1基因为含全部编码区的1.6kb基因组片段，该片段包括大约360bp的5′端非翻译序列，310bp的3′端非翻译序列及960bp的编码序列，SAG1基因上游重复序列可能是启动子单元，它们被界定在DNA中的一个狭小区域内。虽然在SAG1主要转录起始部位上游有一个与CCAATbox同源的60bp顺序，但在这个区域未能证明有那种高等真核生物所具有的TATA启动子的存在^〔3〕。

用P30抗原免疫小鼠可使小鼠免于毒力株弓形虫的致死性感染，但不同株的P30是否具有相同的免疫原性尚无文献报道，经过SAG1基因序列分析发现，RH、C与P3株弓形虫的SAG1基因是高度保守的，至少有97％的同源性，C与P株几乎是相同的，因此推测，弓形虫株的变异可能并不是发展疫苗的一个主要障碍^〔4〕。

应用DNA重组技术研究发现，在长为1404bp的序列中，编码P22的SAG2基因片段有3个，其间有非表达片段。因此，SAG2的cDNA是一种复合cDNA。在该cDNA中有一个597bp的开放读码框架（ORF），后者带一个单一的“框内”起始密码子ATG。在ORF之外的所有3个读码框架内存在多个终止密码子。从而证实了全部翻译序列的存在。抗天然P22的单克隆抗体，能识别重组的P22，此外，采用Weight-matrix分析方法证明，与P30一样，P22也有一个信号顺序，信号肽由主要翻译产物的前26个氨基酸残基组成^〔5〕。

上述SAG1和SAG2仅存在于毒力株弓形虫速殖子阶段。Cesbron-Delauw等研究证实，P43是速殖子与缓殖子均能表达的一种膜蛋白，他用兔抗P43多克隆血清筛选出了3个带EcoRI位点的cDNA克隆，插入片段分别为1500，1100和800bp，它们能交叉杂交，呈相互交搭的限制片段图型，编码P43的SAG3为单拷贝基因，采用RT-PCR和Southern印迹技术研究发现，76K株弓形虫缓殖子体内有P43mRNA转录的发生，最长的cDNA插入片段大小为2.0kb，含有一个长的开放阅读框架，能编码385个氨基酸，起始密码子ATG在第289位处。氨基酸序列中含有一个氨基末端信号顺序及一个糖化磷脂酰肌醇锚锭部位。分析比较P43与P30的氨基酸顺序，二者的同源性不足24％。尽管如此，但它们的半胱氨酸和色氨酸残基的保守分布与重复的结构域提示，二者有相似的分子折叠，可能在功能上2种表膜蛋白也有相似之处^〔2〕。

1.2.2B1基因虽然B1基因产物的生物学功能还不清楚，但该基因是目前被公认为弓形虫高度保守，高度重复的基因之一。用针对P株弓形虫抗原的小鼠多克隆血清及寡核苷酸探针对RH株弓形虫基因组文库进行筛选，得到一个含2.2kbEcoRI基因组片段的重组噬菌体。该片段在基因组中呈串联式重复。研究者任意将之取名为B1基因。应用不同长度的B1质粒和总基因组DNA进行定量Southern印迹分析表明，B1基因重复达25至50倍，根据对每条带放射活性的更精确定量计算可知，在弓形虫基因组中B1基因的拷贝数大约有35个^〔6〕。

由于B1基因的重复特性及广泛保守存在于已知的各株弓形虫体内，所以现在该基因已成为通过扩增特异性B1DNA，从而检测弓形虫的理想靶。

1.2.3α-和β-管蛋白基因研究揭示，弓形虫α-和β-管蛋白基因全部核苷酸顺序长度分别是2761bp和2521bp，二者均为单拷贝基因，测序分析表明两基因含多个内含子。转录单位即α-和β- 管蛋白mRNA的大小分别为2.0和2.1kb，通过比较引物延伸产物带和RNase保护带的大小证实：弓形虫的转录剪接功能缺如，这表明没有5′端其它外显子被用于管蛋白mRNA的合成，此点与动基体目其它原虫不同，弓形虫编码管蛋白是一个基因一个亚单位。然而，管蛋白却能在多种不同的细胞功能中起作用，推测管蛋白在翻译之后发生了修饰。否则很难解释为什么某些单克隆抗体能识别弓形虫纵向细胞骨架的微管而不能识别也由微管组成的顶端类锥体结构。有趣的是弓形虫RNA不仅剪接部位被保留，而且剪接所需的其余信号顺序也存在。在体外，HeLa细胞核提取物能精确地剪接弓形虫的pre-mRNA构造^〔7〕。

1.2.4致密颗粒抗原基因弓形虫进入宿主细胞时，纳虫泡也几乎同时形成，纳虫泡膜上既有宿主细胞成分又有虫体分泌的某些物质掺合与修饰。这种具“杂交膜”性质的纳虫泡不与宿主细胞溶酶体发生融合，藉此弓形虫可以有效地逃避宿主细胞内酶的消化作用与活性氧对之造成损伤而继续发育与增殖。研究纳虫泡膜的虫体成分对于了解弓形虫的寄生机制及研制单克隆抗体干扰其正常寄生均具有重要意义。

致密颗粒是弓形虫的特化细胞器，可能含多种蛋白成分，其中有一些被分泌到纳虫泡膜并参与其形成。Mercier等克隆了一种致密颗粒抗原GRA2基因，该基因长1.3kb，包括一个241bp的内含子，Northern印迹与引物延伸分析证实成熟的mRNA大小为1.1kb，主要翻译产物由一个185个氨基酸的多肽组成，包括一个23个氨基酸的信号肽顺序，该产物富含丝氨酸和苏氨酸残基，提示存在邻位糖基化。GRA2分子内部存在螺旋结构域，后者有2个不同性质的α -螺旋。他们认为，GRA2与纳虫泡内的膜性网状构造有关^〔8〕。

Lecordier等对另一种命名为GRA6的颗粒蛋白抗原的cDNA和基因组插入片段也进行了研究，对编码GRA6的基因和它的侧翼区域进行了全部序列分析，引物延伸实验证明GRA6基因加帽部位在最长一个cDNA插入片段（1600bp）5′端的37bp上游。GRA6基因编码一个230个氨基酸的多肽，该基因不含任何内含子，可能在弓形虫基因组中以单拷贝存在。其产物含2个疏水区，具有跨膜结构域。氨基端结构域并不具备经典的信号肽特征。羧基端亲水区含24％的甘氨酸残基。这些特点表明GRA6在纳虫泡膜网状结构中起较重要的作用^〔9〕。

1.2.5促穿因子基因弓形虫可寄生于人体所有有核细胞，作为弓形虫致病的第一步，弓形虫侵入宿主细胞的方式与机理一直是医学生物学家感兴趣的课题，现在认为，弓形虫进入宿主细胞的方式以主动侵入为主，在此过程中，弓形虫棒状体（rhoptry）分泌的促穿因子起了很重要的作用。ROP1是目前研究较深入的一种促穿因子，分子量60kD，单抗Tg49p能识别ROP1并抑制弓形虫入胞。用单抗Tg49筛选出的λ ROP1克隆含有1个1.64kb插入片段，以此片段作探针,对弓形虫基因组酶切产物进行Southern印迹分析,证实ROP1基因为单拷贝基因，其mRNA大约为2.1kb，从第143个核苷酸到加“A”部位之间区域不含内含子。ROP1多肽序列呈异常的电荷与氨基酸不对称，氨基端富含脯氨酸，酸性很强，接下来是呈强碱性的羧基端，朝酸性结构域方向阅读，肽序中部有一个8肽重复顺序。ROP1不同寻常的氨基酸序列可能是该物发挥促进弓形虫入胞作用的结构基础^〔10〕。

1.3转染、稳定转化与基因替换采用电穿孔法将DNA引入至活的弓形虫体内，便可赋予弓形虫某些表型。Soldati等运用反向PCR与克隆方法构建了SAG1/2CAT质粒，该质粒含氯胺苯醇乙酰基转移酶基因和弓形虫SAG1基因的上游与下游序列，通过电穿孔法将此载体引入游离的弓形虫体内，经上述处理的弓形虫仍具有侵入细胞内寄生的活力，当在人类包皮成纤维细胞中培养一定时间后，可在培养基中检测到CAT的活性。最早是在电穿孔后4h，而且在第一个24h之内CAT适性呈稳定上升。在弓形虫数为10⁶～5×10⁷与质粒含量为5～150μg范围内，CAT活性与虫数和质粒浓度呈正比。最佳电穿孔参数为2.0kv，480hm(欧姆），0.4至0.45ms（毫秒）。此次的转染表达为期9天。由于无法测定每个转染弓形虫的CAT活性，所以用测定CAT活性的方法确定转染效率是不适合的，于是，他们将带有完整SAG1基因的载体转染到SAG1-突变体内，有细胞示踪与抗SAG1产物的单抗进行观察，发现有15％弓形虫于电穿孔处理1天后开始表达转染基因^〔11〕。

以上研究表明，位于上游区域的弓形虫基因能起动CAT的瞬时表达，而CAT是一有效且容易检测的选择标记。试验证明，10μM氯霉素可杀死培基中90％的弓形虫速殖子，而对培基中宿主单层细胞无明显影响。说明弓形虫对该药有高度特异的感受性。若将携带CAT基因且在CAT侧翼有虫体基因（B1基因）的线形或环形质粒引入弓形虫，则赋予该虫氯霉素抗性，在含20μm氯霉素培基中选育，<