登革病毒（Dengue virus,Dv）是引起登革热（DF）和登革出血热（DHF）/登革休克综合征（DSS）的病原体，有4个型别（Dv-Ⅰ、Dv-Ⅱ、Dv-Ⅲ、Dv-Ⅳ）。它流行于热带和亚热带的60多个国家及地区，以东南亚国家最为严重，我国自1978年以来也在海南和广东沿海一带发生了较大的流行。全世界每年约25亿人受感染威胁，病例约6000万，死亡人数3万^〔1〕。各国学者对其实验诊断做了许多工作。

1Dv分离方法的研究

用于病毒分离的标本主要有病人急性期血液、尸检肝、脾、脑、血块等和媒介蚊虫三类。标本采集后立即冷冻保存，尽速送往实验室，以无菌操作将血清稀释成1∶10，组织块和蚊虫标本制备成10％悬液，然后即可用以下三类方法分离病毒。

1.1乳鼠脑内或脑腹内联合接种1944年Kimura和Hotta首次用Dv感染小白鼠Swissalbino系成功。标本采取后立即脑腔接种1～3日龄乳鼠4只，每只0.02ml，放回母鼠罐内饲养，观察7～10天。如乳鼠出现弓背、震颤、倦缩，行动蹒跚等发病表现，即可取出解剖收获鼠脑，以备传代和鉴定。如观察10天不见发病，可取脑盲目传代。该法需多次传代或转种细胞培养，分离阳性率低，现已极少使用。

1.2细胞培养可用脊椎动物细胞或蚊虫细胞培养。1996年Hotta和Evans首次报道登革病毒在单层恒河猴肾细胞增殖成功。60年代末Singh和Paul首次应用蚊细胞培养Dv成功，目前国内外已建立多株对Dv敏感的细胞株。脊椎动物细胞中以LLC-MK2细胞较为敏感。所有细胞株中以白纹伊蚊传代细胞C6/36细胞最为敏感，其对4个型的Dv均能产生CPE，繁殖滴度可达5.0～7.5logSMLD₅₀。目前C6/36细胞微量培养法用得最为广泛，阳性率普遍达44.9～71.8％。1997年江振友^〔2〕等对常规微量细胞培养法作了改进，建立了一种不需预先制备细胞单层的速成甲基纤维素半微量空斑技术，操作简便、快速、重复性好，空斑平均水平高于常规法。但应注意，有些毒株不产生细胞病变，这样的病例就不能通过细胞接种的方法检出。

1.3蚊虫培养1974年Rosen和Gubler首次证明Dv胸内接种白纹伊蚊的可行性，1976年Gubler用该法从69例急性期病人血清分离出45株Dv，阳性率为65％。白纹伊蚊雌雄株对Dv有相同敏感性。用蚊虫作病毒分离的优点是即使血清中含有1∶2～1∶300病毒抗体，也能分离出病毒，而用乳鼠或细胞培养分离患者血清中的病毒，要将血清作适当的连续稀释，如不稀释或稀释倍数低，分离病毒可能失败；但蚊虫的外潜伏期较长，不适宜快速分离病毒，且应特别注意安全，防止感染蚊逃逸。1981年Rosen用巨蚊（Toxorhyn chites)接种Dv获成功，因巨蚊无吸血习性，实验更安全。

大量实验证明，蚊虫分离病毒比细胞培养和乳鼠接种更敏感。

病毒分离是确诊流行病病原最可靠的方法，但费时、繁琐、至少需1周时间才能出结果，达不到早期、快速诊断的目的。

2DV及其抗原的检测

DV分离培养后的鉴定分型，经典方法有血凝抑制试验（HI）、补体结合试验（CF）和中和试验（NT）。以上方法不同程度地存在着敏感性低、特异性差、操作繁琐、耗时等不足，尤其是分型困难。70年代建立了一批新技术用于Dv抗原的检测，使以上缺点有所克服，这些技术主要有免疫荧光法（IFA），酶联免疫吸附试验（ELISA），放射免疫技术（RIA），对流免疫电泳试验，SPA协同凝集试验，固相免疫电镜法，登革免疫印迹法（DBA）等。1980年以后单克隆抗体（McAb）技术用于Dv抗原的检测，使分型问题得到解决。近十多年来，在上述方法的基础上，应用了生物素—亲和素（Avidin-Biotin,AB)等放大系统、硝酸纤维滤膜（NC）等载体，使方法更敏感、特异、安全、简便。

目前检测Dv抗原的方法大多仍离不开细胞或蚊虫培养，如能省去病毒分离培养这一步，直接从血液标本中检出Dv抗原，无疑可做到早期诊断。Monath用McAb-RIA检测病毒血症病人血清中的抗原，检出率达43%～47％，1995年Malergue^〔3〕等建立荧光ELISA（F-ELISA），直接检测病人血液中的Dv抗原，敏感性达90％，特异性达99％，与细胞培养法的一致率达98％。1995年田小东^〔4〕等建立了胶乳凝集法，他用多克隆抗体（PcAb）致敏的三元共聚重氮聚苯乙烯胶乳试剂直接定性检测病人血清中Dv抗原，共检测DF病人急性期血清标本57份，在病程第1～14天均具较高的检出率，检出率为77.19％，与PCR和病毒分离法的符合率分别为82.46％和71.93％，其缺点是不能分型，如能运用McAb，估计可以分型，尚需进一步研究。

3Dv抗体的检测

3.1总抗体/IgG的检测传统的HI、CF、NT试验需双份血清，与其它黄病毒属病毒有交叉反应，敏感性低，操作繁琐。1979年Dittmar用ELISA间接法检测DV的抗体，并应用阻断试验勉强可以分型。1985年陈香蕊对此法进行了改进，病毒分型得到满意解决。1991年Cardosa^〔5〕等建立了酶免疫斑点法（DEIA），在稀释1∶1000的血清中，该法能敏感地检出再次感染者近期感染产生的DV抗体，特异性达97.3％，检出的抗体最高滴度为1∶16000，而IFA为1∶160，CF为1∶64。1992年罗瑞仙^〔6〕等首次将该法介绍到国内。1997年周坚^〔7〕运用该法检测了47例标本，41例阳性，检出时间均在发病后1～7天，其中5天内检出阳性人数占总阳性人数的95.1％，有利于DF的早期诊断。1997年姚海军^〔8〕等建立斑点免疫金渗滤法（Dot immunogold filtration assay,DIGFA），敏感性与DEIA相近，阳性一致率为96.6％，整个检测过程只需5min左右，不需特殊设备，适于在基层实验室推广应用。

3.2IgM的检测有抗体捕捉放免法，酶标抗原免疫法，血细胞吸附的免疫吸附技术（HSIST）及Lam^〔9〕、Innis^〔10〕等使用的IgM抗体捕获ELISA（MAC-ELISA），国内也有很多关于MAC-ELISA的报道^{〔11～13〕}。在以上各种方法中以MAC-ELISA最优。1994年王飞^〔13〕对此作了改进，建立了MAC-AB-ELISA，它具有更高的敏感性和特异性，仅需单份血清，最早在病程第2天或第3天即可检出DV特异性IgM，检出滴度可高达1∶3200～1∶25600，可用于早期诊断，且与其它黄病毒属病毒和类风湿因子的阳性血清无交叉反应，可分型诊断。应当说明，MAC-ELISA查IgM用于DF的早期诊断，受DF潜伏期仅为5～9天的限制，一部份病人发病初始时尚未开始出现IgM的应答反应，从各家报道来看，急性期（症状期）约只有半数病人可检出IgM。尽管如此，与常规的病毒分离法或检查总抗体的方法相比，仍具有一定的早期诊断意义。

4Dv-RNA的检测

近年来随着Dv基因组克隆和序列分析成功及核酸杂交、PCR技术的建立，使Dv感染的诊断达到对病毒RNA检测的分子生物学新阶段。

4.1核酸杂交技术1987年Henchal等用缺口平移法制备成³²P探针，作槽斑点（dot-blot）核酸杂交，能检出最低Dv-RNA量为1pg，该法比抗原捕获ELISA、McAb-IFA敏感64倍。³²P探针虽特异、敏感，但半衰期短，放射性污染不易处理，显影时间长等缺点，限制其推广使用，故目前各种非放射性标记探针已相继用于检测Dv-RNA。1987年Khan等应用光敏生物素（photobiotin）标记的Dv-Ⅱ-cDNA探针与Dv-Ⅱ感染的Vero细胞中的病毒RNA杂交，用亲和素-碱性磷酸酶系统检测，灵敏度达40pg。目前国内外常用的生物素（Biotin,Bio）标记的探针，灵敏度可达1～3pg，比上述光敏生物素标记探针敏感约40倍。其它用于Dv-RNA检测的非放射性标记探针，有用N-2-乙酰氨基芴（AAF）标记的免疫核酸探针^〔14〕及辣根过氧化物酶（HRP）标记探针^〔15〕。前者用磷酸酶系统检测，后者用加强化学发光法（Enhanced Chemiluminescence,ECL）检测。上述四种非放射性探针均可检出pg级的靶核酸，虽不如³²P标记探针敏感，但探针稳定，保存期长（6个月～2年），无放射性污染，使用安全又快出结果，ECL检测用的尼龙膜经处理后还可再次使用。但ECL试剂昂贵，标本中（如血清）的发光底物可致假阳性，且需在暗室中检测；AAF是致癌物质，标记和操作时均需谨慎；生物素探针在NC上的非特异性背景高，影响试验结果的判断。1991年王树声^〔16〕等应用非同位素标记物异羟基洋地黄毒甙配基（Digozigenin,Dig)通过随机引物法(Random Hexanucleotide Primer,RHP)制成Dig-cDNA探针，用斑点杂交检测感染C6/36细胞的Dv-RNA和临床血清标本中的Dv-RNA，结果表明，此探针可测出提纯过的Dv-RNA的最低含量为0.1pg，可测出桂86～5、桂87～1登革热患者血清中Dv-RNA提取液的最高稀释度分别为1/320和1/160～320，其敏感性比用缺口平移法标记的Bio-探针高出近100倍，比Henchal^〔17〕等报道用³²P标记的cDNA探针高10倍，并具有型和种特异性，此外还具有非特异性背景染色低、快速、方法简便、重复性好、安全价廉等优点。Dig随机引物法标记核酸探针有望成为检测临床标本Dv-RNA和流行病学调查的常规快速诊断技术。

核酸杂交法需依赖于病毒的分离培养，从各家报道看，从标本采集到出结果一般需3天^〔18