关键词： DNA探针；肺炎衣原体；斑点杂交

摘要目的建立一种敏感而特异的肺炎衣原体分子生物学检测方法。方法用PCR扩增约460bp的肺炎衣原体种特异性基因片段并标记成探针，建立DNA探针杂交检测肺炎衣原体的方法。结果：探针只与肺炎衣原体AR-39、VR1310株DNA呈阳性杂交斑点，与肺炎衣原体AR-39株全DNA PstI酶切片段在2.5kb处有一阳性杂交带，与其它两种衣原体、Q热立克次体、嗜肺军团菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌DNA斑点膜无阳性杂交信号。从152例有呼吸道疾患的住院病人鼻咽拭子和肺泡灌洗液中检出阳性18例，阳性率12％。结论本文建立的DNA探针检测肺炎衣原体方法具有较高的敏感性和特异性，可用于批量临床标本的检测。

DETECTION OF CHLAMYDIA PNEUMONIAE BY DNA PROBE BLOT

Rao XiancaiYu ShurongZhang Xueet al

(Third Military Medical University，Chongqing 400038)

ABSTRACTAimTo establish a sensitive and specific molecular biological method for detecting Chlamydia pneumoniae of respiratory tract infection patients.MethodsA DNA blot assay was developed by coating DNA of Chlamydia pneumoniae and／or digested from clinical samples on nitrocellulose（NC）membrane，blotting with a DNA probe labeled with DIG.Results There were no positive blotting dot in Chlamydia trachomatis，Chlamydia psittaci，Coxiella burnetii，Legionella pneumophilia，Esherichia coli，Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus except Chlamydia pneumoniae.The sensitivity could be improved lpg.The positive rate was 12％（18／153）in detection of nasopharyngeal swabs and bronchoalveolar lavage samples collected from 152 pneumonic hospitalized patients.Conclusions This method was not only sensitive，rapid and specific but also could be applied to detect batch samples.

KEY WORDSChlamydia pneumoniae DNA probe Dot blot

肺炎衣原体是1989年定名的重要呼吸道病原菌，可致非典型性肺炎、支气管炎、咽炎等急慢性呼吸系统疾患，且人群中感染非常普遍^（1）。我国北京对958名健康儿童（2～14岁）进行血清流行病学调查表明肺炎衣原体IgG阳性率为23.8％^（2）。长沙641名健康人的检测结果为43.7％^（3），重庆238例有呼吸道疾患之住院病人血清IgG抗体阳性率50.8％^（4）。由于肺炎衣原体培养较困难（国内目前尚无明确的分离株），对其所致疾病的实验室诊断主要依靠血清学。本文建立的DNA探针检测肺炎衣原体具有较高的敏感性和特异性，且可用于批量临床标本的检测，现报告如下：

1材料与方法

1.1菌种肺炎衣原体AR-39株购自美国华盛顿研究基金会，VR-1310株及沙眼衣原体L2／434／Bu株由北京协和医院检验科惠赠，沙眼衣原体TE55株由上海医科大学卫生微生物学教研室惠赠，鹦鹉热衣原体B11001株购自中国兽药监察所，嗜肺军团菌LP6、LP8、肺炎链球菌、Q热立克次体九里株、绿脓杆菌、普通大肠杆菌及金黄色葡萄球菌由本室保存。

1.2衣原体培养与纯化按文献^〔5〕进行。

1.3衣原体DNA提取及PCR扩增参照文献^〔6〕。

1.4PCR产物探针的制备将约460bp的肺炎衣原体种特异性扩增片段经低融点琼脂糖回收后，用地高辛（DIG）-dUTP随机引物标记法制成探针，标记条件按试剂盒说明书进行。

1.5探针的敏感性和特异性

1.5.1敏感性检测将10ng的肺炎衣原体AR-39株全DNA，用TE（10mMTris，1mMEDTA，pH8.0）作10倍倍比稀释后，100℃水浴煮沸10min，置冰浴中冷却，负压条件下点于Bio-dot多孔吸印仪中的预先经20×SSC液浸泡20min的硝酸纤维素膜上，室温自然干燥，80℃烘烤2h。按DIG试剂盒提供的方法，用制备好的探针进行预杂交（预杂交液中含5×SSC，0.5％封阻试剂，0.1％N-十二烷酰肌氨酸钠，0.02％SDS）、杂交（杂交液含DNA探针200ng／ml，50％甲酰胺，5％封阻试剂，5×SSC，0.1％N-十二烷酰肌氨酸钠，0.02％SDS）和免疫测定。

1.5.2特异性鉴定

1.5.2.1Southern杂交AR-39株肺炎衣原体全DNA500ng经PstI酶切后转移到硝酸纤维素膜上，用DNA探针进行杂交，以鉴定探针特异性。

1.5.2.2DNA探针的种特异性鉴定在Bio-dot吸印仪上制备沙眼衣原体TE55、L2／434、／Bu株、肺炎衣原体AR-39、VR1310株、鹦鹉热衣原体B11001株，Q热立克次体九里株、嗜肺军团菌LP6、LP8，肺炎链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌全DNA斑点膜，进行探针的特异性杂交试验。

1.6探针用于临床标本检测用特制的木棉棉扦采集1994年5月～1997年12月间住院的肺炎、支气管炎及肺癌等病人的鼻咽拭子124份，收集行纤支镜检查病人的支气管肺泡灌洗液28份。拭子采集后置于含1mlSPG转运培养基（每升含蔗糖75g、KH₂PO₄0.52g、Na₂HPO₄1.22g、L-谷氨酸0.72g、另含庆大霉素20μg／ml，万古霉素50μg／ml，二性霉素B 2μg／ml）的Eppendorf管中，4℃转运到实验室，4℃1400r/min离心15min，沉淀按酚／氯仿法抽提DNA，制备斑点膜，进行探针杂交。同时用一对肺炎衣原体种特异性引物对部分标本作PCR扩增，并将86号和121号标本的PCR产物经琼脂糖电泳后电转移到硝酸纤维素膜上，用DNA探针进行杂交。

2结果

2.1探针的特异性鉴定Southern杂交显示所制备的肺炎衣原体DNA探针与AR-39株全DNA PstI酶切片段在约2.5kb处有一杂交带，表明该探针与肺炎衣原体DNA具有同源性。

DNA探针与5株衣原体及7株非衣原体对照菌株的斑点杂交结果显示仅肺炎衣原体AR-39和VR-1310株出现明显的杂交信号，沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体及7株对照菌株经斑点杂交均阴性。（见图1）

图1DNA探针特异性试验

1，2沙眼衣原体TE55、L2／434／Bu株，3，4肺炎衣原体AR-39、VR-1310株，5.鹦鹉热衣原体B11001株，6-12：分别为Q热立克次体九里株，嗜肺军团菌LP6、LP8，肺炎链球菌，大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌

2.2探针敏感性试验将肺炎衣原体AR-39株全DNA进行10倍倍比稀释，分别制成10ng，1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg的斑点膜，用探针杂交的结果见图2，表明该探针至少可检出1pg的肺炎衣原体DNA。

图2DNA探针敏感性试验。

从左到右分别为10ng，1ng，100pg，10opg，1pg，100fg，10fg。肺炎衣原体AR-39株DNA斑点

2.3临床标本检测152份住院病人的鼻咽拭子和支气管肺泡灌洗液标本经DNA探针杂交检测，阳性18例，阳性率12％。其中86号和121号标本用肺炎衣原体种特异性引物作PCR扩增也阳性，将这两份标本的PCR产物经琼脂糖电泳后电转移到硝酸纤维素膜上，与DNA探针的杂交结果见图3，表明用该探针能从临床标本中检出肺炎衣原体特异性DNA。

图3DNA探针与临床标本PCR产物的Southern杂交

1DNA Marker（pBR322＋AluI） 286号标本 3：121号标本

3讨论

衣原体是专性细胞内寄生物。目前已发现有四个种，即沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ctr）鹦鹉热衣原体（C.psittaci，C.ps），肺炎衣原体（C.pneumoniae，C.pn）和牲畜衣原体（C.pecorum，C.pe）。Cpn是1989年定名的衣原体新种，因其能引起呼吸道感染，并可能与其它多种疾病有关，从而愈来愈受到重视。过去一直认为C.pn只有一个血清型，即TWAR，后者取名于实验室最早的两株Cpn分离株—TW183和AR-39的前两字母之组合。但经单抗反应性证实1993年分离自挪威的Cpn FWL—10株可能为另一个血清型^（7）。此外，据MOMP（主要外膜蛋白）基因的同源性和单抗检测结果证明Cpn种内新增加了两个非人源性衣原体株—KC株和N16株^（8），不过它对动物的致病性尚有待研究。

肺炎衣原体的分离培养较其它衣原体更为困难，分离率很低，常规检测主要以血清学为主，但常需双份血清滴度有4倍以上增长才有现症诊断意义。随着PCR技术的发展，在Cpn的检测和鉴定中也有突出的应用。本文在<