关键词： PCR；斑点热群立克次体；DNA

摘要作者对不明热患者血液，立克次体细胞培养物，疫区的微小牛蜱，野鼠脾脏等标本，应用Rr. 190.70p和Rr.190.602n引物对，进行PCR扩增，检测斑点热群立克次体特异性DNA。检测结果1.20份不明热患者或疑似立克次体病患者血液标本，检出阳性结果的有7份(7／20阳性)。227份不明热患者或疑似立克次体病患者血液标本的细胞分离培养物，检出阳性结果的有14份(14／27阳性)。3.7组微小牛蜱有2组检出阳性结果(2／7阳性)。4.47组野鼠脾脏8组检出阳性(8／47阳性)。

ASSAY FOR SFG RICKETTSIA SPECIFIC DNA BY PCR

Zhan ZhinongLi WenguangWang Huamin et al

(Department of Microbiology and Immunology，Hainan Medical College. Hainan 570003)

ABSTRACTThis paper reports the result of Assay for SFG Rickettsia specific DNA of specimen including patients blood samples,Rickettsia cell cutrureration,Boopilus microplus,field mouse spleen in hainan Island by PCR.The primers is R.r.190.70p and Rr.190.602n.532bp band of SFG Rickettsia Specific DNA were observed in 7/20 patients blood samples,14/27 Rickettsia cell curtureration from blood samples of patents with suspected rickettsiosis or fever unknown organizm,2/7 Boopilus microplus and 8/47 yield mause spleen.

KEY WORDPCRSFG Rickettsia DNA

作者1994年发表了从不明热患者血液中分离出斑点热群立克次体(SFG)的报道，随后继续对不明热患者血液，立克次体细胞培养物，收集自立克次体疫区的微小牛蜱，野鼠脾脏等标本应用选自立氏立克次体(R.rickettsii)190kDa蛋白抗原基因序列设计的引物对(Rr.190.70p和Rr.190.602n)，进行斑点热群立克次体特异性DNA的PCR检测。检测结果报告如下。

1材料与方法

1.1标本

1.1.1患者血液取自海南岛东、南、西、北、中部各农场医院或人民医院的不明热患者或疑似立克次体病患者血液或血块标本20份。－80℃保存待检。

1.1.2细胞培养物上述地区的患者血液或血块标本27份，应用L929或Vero单层细胞培养，在细胞出现50％CPE时，取出细胞混悬液即为细胞培养物标本。－80℃保存待检。

1.1.3微小牛蜱、野鼠脾脏等标本取自海南岛中部大丰农场(该农场人群血清学和病原学以及野鼠血清学调查发现有斑点热立克次体存在)。标本随意分组，分别进行研磨后制成研磨液标本。－80℃保存待检。

1.2引物对应用选自立氏立克次体(R.rickettsii)的190kDa蛋白抗原基因序列设计的引物对 Rr.190.70p和Rr.190.602n(美国UTMB Walker实验室惠赠)。

1.3主要试剂和仪器

1.3.1DNA扩增试剂盒购自上海复华科技开发公司。

1.3.2溶菌酶购自上海细胞生物研究所。

1.3.3蛋白酶KPrimag公司产品。

1.3.4DNA扩增仪gene公司产品。

1.3.5Markers购自BMI公司。

1.4DNA模板的制备参照Furuya^〔1〕方法进行。

1.4.1患者血液患者血块加适量TE溶液研磨成悬液，取200μl抽提DNA。

1.4.2细胞培养物直接取立克次体细胞培养悬液200μl抽提DNA。

1.4.3微小牛蜱根据蜱的大小分组，大的1只一组，较大的4只一组，小的20只一组，共分7组。分别用75％乙醇浸泡30min，再用生理盐水洗3次，取出牛蜱分别加入0.3mlTE溶液中研磨成匀浆，取200μl匀浆液抽提DNA。

1.4.4野鼠脾脏根据脾脏大小分组，大者1个一组，小者2～3个一组，共分47组。分别加入1mlTE溶液研磨成匀浆，取50μl匀浆抽提DNA。

经上述处理过的标本分别加入10％SDS至终浓度为1％，置4℃冰箱过夜，加溶菌酶至终浓度为2mg／ml，冰浴30min，加入蛋白酶K至终浓度0.2mg／ml，55℃水浴60min，用等体积饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提3次，乙醇沉淀DNA，再溶于TE中，4℃保存备用。

1.5PCR扩增^〔1～4〕在加入Tag酶之前先预变性5min，然后按95℃变性40sec，48℃退火40sec，66℃延伸80sec，共30个循环，最后于66℃延伸5min。

1.6DNA检测取上述扩增产物10μl，用1.5％琼脂糖-EB(0.5μg／ml)电泳，以2μl Markers 为DNA分子量对照，然后在紫外灯下观察结果。检出532bp特异性DNA片段者为阳性。

2结果与讨论

2.120份不明热患者或疑似立克次体病患者血液标本检出532bp特异性DNA片段的有7份(7／20阳性)。见图1。

2.227份不明热患者或疑似立克次体病患者血液标本的立克次体细胞分离培养物检出532bp，特异性DNA片段的有14份(14／27阳性)。其中20份标本在立克次体分离前未进行过PCR检测，7份血液标本在立克次体分离前进行过PCR检测，检测结果与分离后的立克次体细胞培养物一致，均为阳性。见图2。

2.37组微小牛蜱有2组检出532bp特异性DNA片段(2／7阳性)。见图3。

图1PCR检测患者血液中的斑点热立克次体DNA

A.Vero细胞培养液

B.正常人血液

C.康氏立克次体培养液

D.患者血液(No：93021)

E.患者血液(No：93023)

F.患者血液(No：93012)

G.puc Mix Marker

图2PCR法检测细胞培养物中的斑点热群立克次体DNA

A.患者血液立克次体细胞培养物

B.患者血液立克次体细胞培养物

C.患者血液立克次体细胞培养物

D.康氏立克次体(R.conori)细胞培养物

E.pUC Mix Marker

F.Vero细胞培养物

图3PCR检测微小牛脾和野鼠脾脏中斑点热DNA

A.正常小鼠脾脏

B.恙虫研磨液

C.康氏立克次体培养液

D.微小牛蜱研磨液(No：3)

E.pUC Mix Marker

F.微小牛蜱研磨液

G.鼠脾脏研磨液(No：14)

H.野鼠脾脏研磨液(No：28)

2.447组野鼠脾脏有8组检出532bp特异性DNA片段(8／47阳性)。见图3。

以上结果表明微小牛蜱可能是海南岛斑点热群立克次体病的传播媒介，野鼠是其储存宿主，进一步支持海南岛存在斑点热群立克次体的论断。

3参考文献

1.Furuya y，Yoshida Y，et al.Specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA from clinical specimens by polimerse chain reaction.J Clin Microbiol，1991，29∶2628.

2.Xuejie Yu，Yan Jin et al.Genotypic and antigenic identification of two new strains of Spotted Fever Group Rickettsiae isolated from China.J Clinical Microbiology Jap，1993，30(1)∶83.

3.Zhang X F，Fan M Y et al.Genotypic identification of conorii strains.Avta Virologica 1994，Short communication 38∶88.

4.陈敏，范明远等.福建省斑点热群立克次体的检测分离及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(6)443.

1998年11月3日收稿