关键词： 恙虫病立克次体；Karp；嵌合式聚合酶链反应；恙虫病立克次体抗原56kDa；克隆

摘要目的为了进一步完善恙虫病立克次体的株型鉴定技术，并且为临床提供诊断试剂。方法本文采用NPCR技术，参考并自行设计两对寡核苷酸引物(P₁、P₂、P₃、P₄)，从恙虫病立克次体Karp株基因组DNA中特异扩增出编码Sta56抗原的部分基因片段，经纯化后用Bam H Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后，克隆到质粒PUC18中，转化大肠杆菌TG₁，经PCR和双酶切鉴定。结果与结论构建了重组质粒PUC18-RK，从而为该基因片段的表达奠定了基础。

MOLECULAR CLONING AND IDENTIFICATION OF A PART OF THE GENE

ENCODING THE 56-KILODALTON MAJOR PROTEIN ANTIGEN OF KARP

STRAIN OF RICKETTSIATSUTSUGAMUSHI

Zhang HaihongLi JiacanZheng XiaoyingXi Zhiyong

(Department of Parasitology，Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou，510089)

ABSTRACT AimIn order to improve the techniques on the identifing strains of R.tsutsugamushi and to provide the diagnostic for the clinic.MethodsThe group-specific and type-specific primers were designed and synthytized from R.tsutsugamushi specific antigen 56kDa (Rttsa56kDa)gene of Karp Strain.The 230bp DNA fragment was amplified by the NPCR.The fragment and pUC18 were seperately digested with Hind Ⅲ and BamH Ⅰ，then the generated fragment was cloned into pUC18-RK was identified with PCR and digested with Hind Ⅲ and BamH Ⅰ.Results and Conclusion The results indicate that pUC18-RK Sta56 recombinant plasmid was conducted.The expression of the Sta56 gene of Karp strain will be further investigated.

KEY WORDSRickettsia tsutsugamushiKarpNPCR56-kDa scrub typhus antigencloning

恙虫病立克次体(Rt)是严格细胞内寄生的微生物，繁殖慢，组织培养难以获得大量纯化的立克次体，这就影响了对抗原的深入研究。而重组DNA技术和聚合酶链反应技术(PCR)的发展为解决以上困难提供了有力手段。作者曾采用嵌合式聚合酶链反应(NPCR)对广东、海南等地恙虫病流行区Rt株型鉴定，结果证实该地流行株为Karp株。本文进一步采用基因扩增及重组技术对Karp株特异的Sta56的部分基因片段进行克隆研究，以期为诊断试剂盒的研制提供阳性模板对照。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1恙虫病立克次体株国际标准株Karp株由福建省卫生防疫站于恩庶教授提供。恙虫病患者标本立克次体Karp株由佛山市第一人民医院罗红涛医师提供。

1.1.2克隆载体和宿主菌克隆质粒pUC18及大肠杆菌TG₁均为本室保存。

1.1.3NPCR引物据已知Sta56基因序列参照Furuya Y^［1］合成一对群引物。P₁：5＇-TTGCTAGTGCA

ATGTCTGC-3＇，P₂∶5＇-CCCTGCTGCTGTGCTTGCTGG

G-3＇

另外参照Furuya Y^［1］并自行设计合成Karp株特异的引物对，两条引物5＇端分别引入Hind Ⅲ和Bam H Ⅰ限制性酶切位 点。上游引物P₃：5＇-CCGGATCCTCAGCCTACTATAATGCC-3＇，下游引物：P₄：5＇-GCTTCGAACAATATCGGATTTATAACC-3＇

其中GGATCC为限制性内切酶Hind Ⅲ的酶切位点。

TTCGAA为限制性内切酶Bam H Ⅰ的酶切位点。

两引物5＇端的CC及CG均为保护性碱基。

1.1.4主要试剂DNA提取试剂蛋白酶K为Promage公司产品，溶菌酶及SDS均购自本校遗传教研室；PCR试剂均为广东加拿大真达公司产品；限制性内切酶Hind Ⅲ和Bam H Ⅰ及PCR Marker均为广东华美公司产品，DNA T₄连接酶为Promage公司产品。

1.2方法

1.2.1恙虫病立克次体Karp株DNA的制备

-70℃保存的佛山病人Karp株血标本，参照文献^［2］抽提DAN，-20℃保存于TE中备用。

1.2.2目的基因片段的NPCR扩增反应总体积50μl，加样顺序如下：双蒸水32.2μl，10×PCR buffer 5 μl，2mM dNTP 5 μl，引物P₁、P₂各1μl，DNA模板5μl，Taq酶0.8μl(2u／μl)，混匀后加入灭菌石腊油50μl，稍离心。反应条件：^［1，3］94℃30s，57℃ 2min，70℃ 2min，共30个循环，最后70℃再延伸5min，然后取第一次PCR产物5μl做模板，引物改为P₃、P₄，余操作不变，进行第二次PCR，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3目的基因的纯化回收、克隆及鉴定NPCR产物及质粒pUC18经Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ双酶消化后，再分别用1.5％低熔点琼脂糖凝胶回收。目的基因与载体按3∶1摩尔比混合，在10μl反应体系中，16℃连接14h^［4］，取连接产物转化大肠杆菌TG₁，在含Ampicilline的LB平板上随机挑取20个单菌落，按碱裂解法抽提质粒DAN后，分别双酶切鉴定，1.2％琼脂糖电泳鉴定重组质粒，阳性者再行PCR鉴定。

2结果

2.1目的基因片段PCR扩增结果本文设计合成两对引物，理论上扩增出片段应为230bp大小，图中(图1，2)显示PCR产物于1.2％胶电泳后，在PCR Marker近237bp处有一条带，与预计片段大小相符。

图1pUC18-RK阳性重组子酶切鉴定结果

1.DNA标准分子量(PCR Marker)

2.阳性对照Karp株

3.pUC18对照

4.pUC18-RK阳性重组子

Fig1.The identification of the pUC18-RK by digestion with restriction enzyme.

1.PCR Marker

2.Positive control Karp strain

3.pUC18

4.pUC18-RK

图2pUC18-RK阳性重组子PCR鉴定结果

1.DNA标准分子量(PCR Marker)

2.阳性对照Karp株

3.PUC18-RK阳性重组子

4.PUC18对照

Fig2.The identification of PUC18-RK by PCR

1.PCR Marker

2.Karp strain

3.PUC18-RK

4.PUC18

2.2重组质粒的鉴定因本目的片段较小，仅230bp，用快速酚法初筛不易比较重组质粒的泳动快慢，故本文采取随机挑20个单菌落，全部直接用碱裂解法抽提质粒DNA后，用Hind Ⅲ，Bam H Ⅰ双酶切，电泳分析结果示其中仅有一个质粒得到一酶切片段，大小与外来基因的插入片段大小相符(图1)，以该重组质粒的DNA作模板，进行PCR扩增，扩增产物经电泳可观察到在PCR Marker 237bp前沿有一条带，与以Karp株Sta56基因组DNA为模板的PCR扩增产物大小一致(图2)，证明所得的重组质粒为带有Karp株特异的Sta56部分基因片段的分子克隆。

3讨论

Sta56kDa抗原是恙虫病立克次体的主要外膜蛋白抗原，有些学者证明该抗原可能与Rt的致病性和毒力变异有关^［5～6］。Sta56含有株特异性抗原决定簇，不同的分离株所引起的临床表现及治疗也不同，因此加强Rt株型方面的研究是很有必要的。作者在先期已经进行了Rt的NPCR株型鉴定工作，证实广东、海南两地流行株为Karp株，因我国恙虫病自然疫源地主要集中于南方，故将Karp株特异的Sta56部分基因片段，克隆到pUC18载体中，使大量制备纯化的立克次体抗原成为可能，进一步完善了恙虫病立克次体的株型鉴定技术，为诊断试剂盒的研制提供了阳性模板对照。进一步的研究还可将Karp株Sta56克隆后进行表达，为基因工程疫苗的研究奠定物质基础。

4参考文献

1.Furuya Y，et al.Serotype-Specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA by NPCR.J Clin Microbiol，1993，31(6)∶1637.

2.Furuya Y，et al.Specific amplification of<