关键词： 恙虫病立克次体；56-kDa蛋白；分子克隆

摘要目的克隆恙虫病立克次体Gilliam株56-kDa蛋白基因，作为优化PCR反应时的标准模板和为Gilliam株56-kDa蛋白基因的表达作准备。方法利用PCR反应和T载体分别扩增和克隆目的基因片段，并用序列分析方法鉴定克隆基因的正确性。结果克隆的基因为恙虫病立克次体Gilliam株56-kDa蛋白基因。结论利用PCR反应和T载体可以从少量的标本中，高效获得高纯度的目的基因。

MOLECULAR CLONING OF 56-KDA PROTEIN GENE OF ORICNTIA TSUTSUGAMUSHI

GILLIAM AND SEQUENCE DETERMINATION OF ITS 5’AND 3’TERMINAL ENDS

Niu HuaChen XiangruiYu QiangZhang YongguoZhang XueyingCheng Cong

(Institute of Transfusion，Academy of Military Medical Science.北京100850)

ABSTRACTAimIn order to optimize the condition for PCR and prepare for expression of 56-kDa protein，the gene encoding 56-kDa protein of Orientia tsutsugamushi Gilliam was cloned and two ends were sequenced.MethodsPCR and T-vector were used to amplify and clone 56-kDa protein gene，respectively.Sequence analysis was performed to identify the cloned gene.Result The gene encoding 56-kDa protein of Gilliam was cloned.ConclusionHigh-pure gene fragments could be obtained from little amount of sample through PCR and T-vector.

KEY WORDSOrientia tsutsugamushi56-kDa proteinMolecular Cloning

恙虫病立克次体(Orientia tsutsugamushi)是一类专性活细胞内寄生的革兰氏阴性菌。有47-kDa，56-kDa，58-kDa等多种菌体蛋白，其中56-kDa蛋白是位于菌体表面的血清型特异性抗原(Sero-type specific antigen，TSA)，其决定恙虫病立克次体不同血清型别^［1］。目前PCR检测方法已广泛用于恙虫病立克次体的检测，所用引物大多来源于56-kDa蛋白基因序列^［2，3］。为探索PCR检测方法的标准化，首先应制备出标准化的模板，为此我们克隆了Gilliam株56-kDa蛋白基因，并用序列分析方法鉴定克隆产物的正确性。同时，恙虫病立克次体56-kDa蛋白也是一个优势抗原和免疫保护性抗原，重组的56-kDa蛋白用于临床检测和实验动物的免疫保护实验，获得了很好的效果^［4，5］。

1材料和方法

1.1核酸的提取取感染恙虫病立克次体的小鼠脾脏0.5g，加4.5ml蛋白酶K消化缓冲液(10mM Tris.Cl (pH8.0)，5mM EDTA (pH8.0)，0.5％ SDS研磨。研磨物加蛋白酶K (20 mg／ml)至终浓度0.5 mg／ml，50℃水浴6h。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。沉淀洗涤后溶于40μlTE (10mM Tris.Cl (pH8.0)，1mM EDTA (pH8.0))。

1.2PCR扩增利用来源于恙虫病立克次体56-kDa蛋白基因的一对引物A和B扩增Gilliam株56-kDa蛋白基因^［6］。引物A (5'-AAATTATGTT

AATTGCTAGTGCAATGTCTG-3')位于Karp株56-kDa蛋白基因起始密码子下游8-37核苷酸处，引物B(5'-CTAGAAGTTATAGCGTACACCTG

CACTTGC-3')位于Karp株56-kDa蛋白基因起始密码子下游1569-1598核苷酸处。利用引物A和B预期可扩增出约1.6kb的PCR片段。PCR反应在50μl反应体系中进行。该反应体系包括：50mM KCl，10mM Tris.Cl (pH8.3)，2mM MgCl₂，100μM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，1μl模板，引物A和B分别为400nM。PCR反应条件如下：94℃变性45sec，72℃延伸120sec，56℃复性sec。反应同时设立阴性对照和空白对照。

1.3T-载体的制备T-载体的制备参照Marchuk进行^［7］。10μg Bluescript质粒经150 U限制性核酸内切酶EcoR V完全酶切消化，酚／氯仿抽提，乙醇沉淀回收酶切的Bluescript质粒，在4mM dTTP和Taq DNA聚合酶(4 U／μg DNA底物)存在下，于72℃反应4h进行加T反应，酚／氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于30μl水中。

1.456-kDa蛋白基因的克隆低熔点琼脂糖凝胶纯化的PCR产物与T-载体，以摩尔比3∶1，在8 U T₄ DNA 连接酶的作用下，12℃连接16h。连接产物转化1TSS制备的XL-Blue感受态细菌^［8］。在涂布有IPTG和X-Gal的平板上筛选白色菌落，同时利用菌落PCR方法鉴定所筛选的菌落^［9］。

1.5序列分析利用Sanger的末端双脱氧链终止法对克隆的PCR片段5'-和3'-端进行序列分析。测序反应利用USB测序试剂盒进行。测序引物为T7和T3引物。实验操作按试剂盒使用说明书进行。

2结果

2.1PCR扩增利用引物A和B可扩增出恙虫病立克次体Gilliam株56-kDa蛋白基因几乎完全序列。扩增片段的大小为1.6kb，与预期的结果一致。同时阴性对照和空白对照均未出现与预期大小一致的扩增带(图1)。表明此PCR反应是特异的。

图1恙虫病立克次体Gilliam株56-kDa蛋白基因1.6kb片段PCR扩增结果

M：PBR322 DNA／HinfI Marker;1∶Gilliam;2∶阴性对照；3：空白对照

Fig.1 Result of PCR amplified 56-kDa protein gene of Orientia tsutsugamushi Gilliam

M∶PBR322DNA／HinfI Marker;1.Gilliam strain;2.Negative control;3.Blank Control

2.2序列分析T7测序引物测序结果(图2)：AAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCATTG

TCATTGCCGTTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGG

TGAGGAAGGAGGATTAGAGTGTGG

T3测序引物测序结果(图2)：CTAGAAGTT

ATAGCGTACACCTGCACTTGCCATAAGAGG

ATTTATTGAATACTTCTCTTCTATTTTACT

GAATGAGTGCATATAACTACCTTCTAAG所测序列分别与已发表的Gilliam株56-kDa蛋白基因5'-和3'-末端序列相应部分完全一致。证实PCR扩增产物和克隆的基因均为Gilliam株56-kDa蛋白基因。

图2恙虫病立克次体Gilliam株56-kDa蛋白基因5'-和3'端序列分析结果

T₇∶T₇引物测序结果；T₃∶T₃引物测序结果。

Fig.2 Results of sequence determination of two ends of gene coding 56-kDa protein of Orientia tsutsugamushi Gilliam.

T₇：Result of sequencing with primer T₇；T₃：Result of sequencing with primer T₃.

3讨论

近年来，恙虫病疫区扩大，病例增多^［10］。并且由于误诊，已有死亡病例的报告^［11］。建立快速有效的恙虫病诊断方法是确诊的关键。近年来，PCR技术已广泛用于恙虫病的临床诊断。PCR方法具有检测灵敏性高的优点，适合用作早期诊断。但PCR反应易受各种因素的影响，不稳定。为建立一套灵敏，稳定的PCR检测系统需要对其各种影响因素进行优化，例如：不同引物的选择。首先应获得一易于精确定量，纯度高的模板。在本实验中，利用PCR和分子克隆产生的模板能够胜任这一要求。另外利用重组技术产生的恙虫病立克次体56-kDa蛋白作为ELISA的抗原，用于临床检测已获得很好的效果。克隆Gilliam株56-kDa蛋白基因为今后的蛋白表达奠定了基础。

4参考文献

1.Tamura A et al.Analysis of polypeptide composition and antigenic components of Rickettsia tsutsugamushi by polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting.Infect Immun，1985，48(3)∶671.

2.Aawamori F et al.Two-step polymerase chain reaction for diagnosis of Scrub Typhus and identification of antigenic variants of Rickettsia tsutsugamushi.J Vet Med Sci，1993，55(5)∶749.

3.Furuya Y et al.Serotype-specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA by nested polymerase chain reaction.J Clin Microbiol，1993，31(6)∶1637.

4.Kim IS et al.High-level expression of a 56-Kilodalton protein gene (bor56) of Rickettsia tsutsugamushi Boryong and its applification to enzyme-linked immunosorbent assays.J Clin Microbiol，1993，31(3)∶598.

5.Seong SY et al.Induction of neutralizing antibody in mice by immunization with<