关键词： 新生儿；衣原体；聚合酶链反应

摘要目的用聚合酶链反应检测新生儿衣原体感染状况。方法参照文献报道的沙眼衣原体及肺炎衣原体基因序列，分别设计一对引物，采用PCR法检测住院新生儿衣原体感染。结果因呼吸道感染住院的123名新生儿的咽拭子标本，沙眼衣原体及肺炎衣原体感染率分别为13.8％和4.9％。结论PCR检测沙眼衣原体及肺炎衣原体感染具有特异、敏感、快速的特点，可为临床诊断提供科学依据。

DETECTION OF CHLAMYDIAL INFECTION

IN NEWBORN BY POLYMERASE CHAIN REACTION

Ding XiuyuanGuo ZhanggaiXie Xiaohua

(Capital Institute of Pediatrics，Beijing 100020)

ASTRACT AimDetection of chlamydial infectious condition in newborn with polymerase chain reaction.MethodsA pair of primers each were synthesized according to genic sequences of chlamydia trachomatis and chlamydia pneumoniae in the references.The chlamydial infections in newborn were detected with PCR.ResultsCt and Cp positive rates were 13.8％ and 4.9％ respectively in the nasopharyngeal secretion samples collected from 123 hospitalized newborn with different diseases.ConclusionsPCR in a sensitive，rapid and specific method for diagnosis of chlamydial infection.

KEY WORDSnewborn childrenchlamydiapolymerase chain reaction

衣原体是一大群与革兰氏阴性菌有密切关系的原核细胞微生物，对多种抗生素及磺胺类药物敏感，近年来发现沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis.Ct)、肺炎衣原体(Chlamydia pne-umoniae.Cp)分别是泌尿生殖系统及呼吸系统感染的重要致病菌，其对人体的危害，已引起人们的广泛重视。我们采用聚合酶链反应(PCR)对123名新生儿的咽拭子标本检测Ct、Cp感染，现报告如下。

1材料与方法

1.1咽拭子标本DNA的提取取因呼吸道感染(上感、肺炎等)住院的新生儿咽拭子标本(共123份)，放入尿素支原体培养基(2ml)管中，挤压咽拭子使标本充分洗下，取200～300μl用快速碱变性法处理，12000×g离心10min，沉淀用PBS(pH7.2)洗2次，弃上清液，加2mmol／L的NaOH30μl，100℃煮沸10min，8000×g离心1min，取上清液作模板。

1.2引物根据文献^［1，2］报道，设计沙眼衣原体引物序列为CT-1∶5＇-AACTCAAAACCCTCTCATTCTCAA-3＇，CT-2∶5＇-AAACGTTCGTCCCAGGAAGAAGCC-3＇，预期扩增片段长度为182bp。肺炎衣原体引物为HL-1∶5＇-GTTGTTCATGAAGGCCTACT-3＇，HR-1∶5＇-TGCATAACCTACGGTGTGTT-3＇，预期扩增片段约437bp。

1.3PCR反应条件PCR反应体积25μl(DNA扩增仪为中国科学院遗传研究所生产的90A型)，检测Ct的反应中，每种引物为0.3μmol／L，dNTP100μmol／L，临床标本提取物10μl，加入TaqDNA聚合酶和矿物油后，于DNA扩增仪进行PCR，循环条件为94℃预变性3min后，94℃20sec，63℃20sec，72℃1min，循环32次后于72℃再延伸10min。

检测Cp的PCR反应每种引物为0.3μmol／L，dNTP50μmol／L，其余同上。循环条件为94℃预变性3min后，94℃1min，56℃1min，72℃1min，32次循环后于72℃再延伸5min。在全部标本的检测中，每次试验均设已知阳性及阴性(培养基)样品为对照，以确保试验的可靠性。

1.4扩增产物检测取10μl扩增产物与2μl溴酚蓝混合，加样于2％琼脂糖凝胶，为确定特异扩增片段大小，同时上样PBR322／MSP1，电泳100V，30min，紫外灯下观察结果。

2结果

123名住院新生儿咽拭子标本的Ct及Cp检测阳性率分别为13.8％(17／123)；4.9％(6／123)，PCR扩增产物阳性片段Ct为182bp见图1，Cp为437bp见图2。

图1PCR检测的Ct阳性特异扩增片段

Fig 1 Detection of Result Ct position by PCR

图2PCR检测的Cp阳性特异扩增片段

Fig 2 Detection of Result Cp position by PCR

3讨论

人的衣原体病是指由衣原体属病原体引起的一系列疾病群的统称。近年来发现Ct、Cp仅对人类致病^［3］，这二种衣原体感染国内外均见报道。随着现代分子生物学的发展，对衣原体的研究及临床诊断已进入分子水平。我们参照文献^［1，2］报道的Ct和Cp基因序列分别合成了检测Ct、Cp的两对特异性引物，所检测到的Ct、Cp阳性特异扩增片段大小与Pao及Campbell等的报道一致，为单一扩增区带，分别是182bp；437bp。

研究提示沙眼衣原体主要引起人的沙眼，包涵体性结膜炎，性病淋巴肉芽肿，非淋菌性尿道炎，宫颈炎及婴儿肺炎等。国外对沙眼衣原体病的研究，多集中在泌尿生殖道感染及新生儿感染。Hillis^［4］(1994)的研究表明，在育龄妇女中由Ct引起的生殖器感染高达15％，国内的调查也发现女性由Ct引起的泌尿生殖道感染率为19.4％^［5］。对Ct感染的孕妇，Ct可引起胎儿的先天性感染，董兆文等以孕2月人工流产的绒毛组织为样品，检测到沙眼衣原体感染率为5.1％。本研究发现，住院新生儿Ct感染率为13.8％，可能为胎儿期先天性感染或出生时通过感染的产道引起。

肺炎衣原体是呼吸系统感染的重要病原菌，传播途径是人传染人。主要引起人的非典型性肺炎，还可致气管炎、咽喉炎、鼻窦炎及心内膜炎等疾病。此外，Cp慢性重复感染也相当普遍，尤其是近几年来发现其慢性感染可诱发动脉粥样硬化和冠心病，严重危害人类健康。支文靖^［6］等用微量免疫荧光法对北京958名，2～14岁健康儿童进行Cp感染的血清学调查发现，总体阳性率为23.8％，且感染率随年龄增长而升高。本研究中Cp感染率为4.9％，与Jantos^［7］的观察相似，即婴幼儿Cp感染率较低。

总之，PCR检测衣原体感染与其它方法相比(如细胞分离培养、血清学方法等)具有特异、敏感、快速等优点，适宜在临床推广应用，以便做到早期诊断，及时有效的治疗。在新生儿，Ct感染率明显高于Cp，因此，对Ct的检测尤为重要。

4参考文献

1.Pao CC，Kao SM，Wang HC，et al.Intraamniotic detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid sequences by polymerase chain reaction.Am J Obstet Gynecol，1991，164∶1295.

2.Campbell LA，Melgosa MP，Hamilton DJ，et al.Detection of Chlamydia pneumoniae by polymerase chain reaction.J Clin Microbial，1992，30∶434.

3.杨宜生，姜天童，方雨玲编著.人兽共患病人类衣原体和动物衣原体.武汉：湖北科学技术出版社，1993.283.

4.Hillis SD，Nakashima A，Marchbanks PA.et al.Risk factors for recurrent Chlamydia trachomatis infections in women.Am J Obstet Gynecol，1994，170∶801.

5.李永哲，倪安平，汪波等.应用荧光免疫法检测泌尿生殖道沙眼衣原.中华医学检验杂志，1995，18(1)∶29.

6.支文靖，王兴河，武万水等.北京市958名健康儿童肺炎衣原体感染的研究.中华流行病学杂志，1996，17(2-A)∶83.

7.Jantos CA，Wienpahl B，Schiefer HG，et al.Infection with chlamydia pneumonia in infants and children with acute lower respiratory tract disease.Pediatr Infect Dis J，1995，14∶117.

1998年7月15日收稿