关键词： 弓形虫；聚合酶链反应；实验感染兔

摘要目的建立敏感、特异、稳定的聚合酶链反应(PCR)法，以检测弓形虫感染。方法建立PCR法，确定最佳扩增条件；用PCR法检测实验感染家兔血液中DNA的动态变化，并与ELISA法检测CAg进行比较。结果兔感染弓形虫后第2d，PCR开始出现阳性，阳性率为76.9％(10／13)，总检出率达100％。与ELISA法查CAg进行平行检测，前者出现阳性时间早，且阳性率明显高于后者。该法敏感性高，可检测到10fg DNA含量；特异性强，对其它9种寄生虫和微生物DNA均无交叉现象；稳定性好，对阳、阴性同一样品重复5次，结果一致。结论提示本法可用于临床诊断，在一定范围内替代病原学和免疫学检测。

LABORATORY RESEARCH ON DETECTING

TOXOPLASMA INFECTION BY PCR

Gan Shaobo Tong Yupin Yi Qingyuan

(Beijing Tropical Medicine Research Institute,Beijing 100050)

ABSTRACTAim：To establish a sensitive，specific and stable PCR technique for detecting toxoplasma infection in experimental rabbits.Method PCR technique was established and different amplified conditions were compared to detect the dynamic variation of serum DNA of toxoplasma in experimental infected rabbits then using the technigue.at the same time to detect CAg with ELISA method.Results DNA of toxoplasma could be detected as early as the second day from 10 out of the 13 rabbits after infection with a positive rate of 76.9％.At the 30th day，the positive rate reached the highest value 91.7％(11／12).The total detection rate of toxoplasma DNA was 100％.

In comparison with CAg detecting by ELISA parallelly performed，this method is more sensitive for as little as 10fg of DNA could be detected.Besides，the positive results could be detected earlier and the positive rate was higher than that of ELISA.This method is also very specific.No corss reaction was found with the DNA of nine other parasites and microorganisms.Identical results were obtained when a positive or a negative sample was tested repeatedly for five times，showing that this method is quite stable and reliable.Conclusion PCR can be used for clinical diagnosis of toxoplasmosis and to some extent，it can replace the conventional immunological and pathogenical examinations.

KEY WORDSToxoplasam Polymerase chain reaction Experimentally infected rabbit

弓形虫病是一种人兽共患病，呈世界性分布。先天性弓形虫病在胎儿或婴幼儿可出现发育畸形、智力障碍、脑炎、脑膜炎甚至死亡等复杂的临床表现。在免疫抑制及免疫缺陷人群，如器官移植、恶性肿瘤及艾滋病患者等，获得性弓形虫病又可是致死病因之一^［1～4］。弓形虫病缺乏特异性临床症状和体征，诊断较为困难。目前采用病原学检查方法，检出率低；免疫学诊断方法也多受机体免疫状态以及方法本身敏感性和特异性的影响。近年来，一种直接检测病原体核酸的PCR技术在国内外已有报道^［5～7］。本实验对弓形虫PCR检测方法的实验条件、敏感性、特异性等作了进一步研究；对实验性感染弓形虫兔全血在用PCR法进行动态检测的同时还应用ELISA法对血清循环抗原(CAg)进行了对比检测。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1弓形虫虫株RH株(国际标准强毒株)，FR株(福建兔株)，BH株(北京畸胎儿株)，BP株(北京豚鼠株)，BC株(北京猫株)，均在本所保种传代中。

1.1.2引物参照Burg等^［8］文献设计引物，由中科院微生物研究所合成。

引物1∶5＇GGAACTGCATCCGTTCATGAG3＇(694-714bp)

引物2：5＇TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3＇(887-868bp)

该引物来自B1基因，扩增片段长度为194bp。

1.1.3试剂Taq DNA聚合酶，dNTP、分子量标准等，为华美生物工程公司产品。

1.1.4其它寄生虫与微生物对照提取卡氏肺孢子虫、隐孢子虫、杜氏利什曼原虫、溶组织内阿米巴、沙眼衣原体、肺炎支原体、巨细胞病毒、EB病毒、结核杆菌的DNA作为对照。

1.1.5弓形虫循环抗原ELISA检测试剂盒(购自浙江省医科院寄生虫病研究所)。

1.1.6实验动物健康大耳白家兔13只，3月龄，体重2.0～2.5kg(购自首都医科大学实验动物中心)。

2方法

2.1引物分析用PCRDESN软件分析该对引物，其符合设计引物的原则；应用DNASIS软件进行引物同源性分析，显示引物1在3＇端有8个碱基与01基因序列中第808-816位碱基同源。

2.2DNA模板提取

2.2.1虫体纯化与消化将腹腔感染RH株弓形虫3d的小鼠处死，用生理盐水冲洗腹腔，腹腔冲洗液用纤维素粉过滤法^［9］纯化虫体。将滤过液离心弃上清，将沉淀悬浮于裂解液中于55℃水浴消化3-4h，置100℃煮沸10min，冷却至4℃。

2.2.2DNA提取参照Keller等方法^〔10〕，将上述消化液分别用苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，无水乙醇沉淀。以适量TE缓冲液溶解DNA，紫外分光光度计测OD值，再计算DNA浓度，按不同数量级进行倍比稀释(1ng／μl～10fg／μl)。

2.2.3人、鼠、兔等基因组DNA的制备参照《Molecular Cloning》从哺乳动物血细胞样品中分离DNA的方法获得^〔11〕。具体方法，取全血0.2ml加入5倍体积的0.83％氯化铵溶液中，冰浴20min，6000r/min离心5min，弃去上清，细胞沉淀中再加入1ml上述溶液，重复以上操作1～2次，尽量去除残存的红细胞碎片。最后将沉淀悬浮于250μl裂解液中。以后消化和DNA提取过程同上。

2.3PCE检测弓形虫方法的建立参照Burg等^［8］建立的PCR检测弓形虫方法，并稍加改良。PCR反应程序：

2.3.1预变性94℃3min，再行扩增循环。94℃1min，55℃1min，72℃5min，35个循环；末延伸72℃5min。

2.3.2产物分析采用琼脂糖凝胶电泳分离。制备含0.5mg／ml溴化乙锭的2％凝胶，水平槽电泳，取10μl扩增产物及2μl6×加样缓冲液点样，0.5×TBE电泳缓冲液电泳，电压5V／cm，约1h后紫外光(λ＝254nm)下观察结果，若为阳性于194pb处可出现一条特异性荧光带。

2.3.3适宜PCR反应条件的确定在PCR反应中采用不同的变性时间、退火温度、循环次数、引物浓度，Mg^＋＋浓度等，以求获得最佳的实验条件。

2.3.4本实验还采用两温法(94℃变性30s，60℃～64℃退火，45s)与三温法进行了比较。

2.4家兔弓形虫感染模型的建立及血液的采集

家兔感染模型的建立取感染弓形虫BH株的小鼠腹水，用血细胞计数板计数，以5×10个虫体腹腔注射感染家兔。家兔于感染后3～7d出现一过性低热、厌食等表现，一周后恢复正常，其中第9号兔于感染后第24d死亡。(于家兔感染前及感染后不同时间(第2、4、6、9、12、16、16、20、25、30d)采血。

将采集的血液分两部分收集，一部分为1.2ml置含0.2mlACD抗凝液的离心管中，充分混匀，立即－20℃冻存，以做PCR用。另一部分为2ml置于试管中，分离血清置－20℃冻存，以做ELISA用。

2.5感染兔血清CAg检测采用单抗双抗体夹心ELISA法，按试剂盒使用说明进行检测，受检血清与阴性参考血清OD均值比值≥2.1者判为阳性。对于结果可疑者重复测试确定。

3结果

3.1弓形虫PCR检测方法的建立及适宜扩增条件的确定弓形虫DNA经扩增后电泳检测，可见于194bp处有清晰扩增带，阴性对照无DNA带。经扩增比较得出(1)引物用量在40pMol以上时即可得到清晰扩增带。(2)Mg^＋＋浓度以2.0OmMol时扩增带较清晰。(3)循环时间当变性、退火、延伸时间在30s以上时皆可检出0.1pg弓形虫DNA。时间过短则检测敏感性只达1pgDNA。(4)循环次数在40个以上时可检出0.1pgDNA。(5)退火温度在55℃以下时有非特异性扩增现象，即除194pb左右扩增带外，于80bp左右尚有一非特异带，当退火温度达60℃时，则此非特异扩增带消失。综上，本研究确定的PCR适宜扩增条件：引物用量为40pMol;MgCl₂浓度为2.OmMol；循环条件为预变性94℃3min，三温循环94℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环，末延伸72℃5min。

3.2两温循环法两温条件为94℃30s，60℃45s。其可