关键词： 生殖支原体；非淋球菌性尿道炎；套式聚合酶链反应

摘要为了探讨生殖支原体（Mg）与非淋球菌性尿道炎（NGU）的关系，我们建立了套式PCR法对216例NGU病人尿道（阴道）分泌物标本做了Mg检测。分别扩增得到296bp和371bp片段。套式PCR扩增片段经E.coRI酶切和与γ³²P-ATP标记的MGS-I探针做斑点杂交，均证明扩增片段为Mg-Pa。此方法灵敏度为10³cfu／ml。用此引物对其它8种支原体扩增均为阴性，具有高度的特异性。实验结果表明，NGU患者Mg-PaDNA总阳性率为7.8％（17／216）正常人群阳性率1.2％（1／81），两组有显著性差异（x²＝3.985，P＜0.005）。从不同性别比较，男性NGU Mg-DNA检测阳性率10.2％（7／68），女性6.7％（10／148），男性略高于女性。成人与儿童比较，成人NGU Mg-DNA检测阳性率10.3％（11／106）儿童检测阳性率5.4％（6／110），成人略高于儿童，统计学亦无显著性差异。结果提示Mg是NGU病原体之一，在正常人群中也检测出阳性，说明它有正确寄居的可能性。

DETECTION OF MYCOPLASMA GENITALIUM IN NONGONOCOCCAL

URETHRITIS BY NESTED PCR

Lu JieZhao XiaoyuanLiu Xiaoyanet al

（Capital Institute of Pediatrics，Beijing，100020）

ABSTRACTTo elucidate the relationship between Mycoplasma genitalium（Mg）and nongonococcal urethritis（NGU），we designed two set primers sequence from DNA fragments encoding Pa adhesin gene of Mg and established nested PCR for detecting Mg-DNA．The Mg-DNA positive rate in 7．8％（17／216）NGU population was significantly high than in 1．2％（1／81）normal person（x²＝3．985，P＜0．005）．Results indicate that Mg is a pathgene of（NGU）or a conditional pathgene in normal person．

KEY WORDSMycoplasma genitaliumNongonococcal urethritisNested PCR

目前人们开始关注生殖支原体（Mycoplasma genitalium Mg）生物学和致病性的研究。现已证明Mg与人类非淋球菌性尿道炎(Nogoncoccal Urethritis NGU)密切相关。由于Mg生长非常缓慢，分离困难。阻碍在临床上的研究。本研究建立了套式聚合酶链反应（nested PCR）对216例临床诊断为NGU患者尿道或阴道分泌物样本进行了Mg-DNA的扩增。为阐明生殖支原体是非淋球菌性尿道炎的病原体之一提供依据。现将初步结果报告如下。

1材料与方法

1.1样品采集及制备1997年6月及1998年7月从我所附属儿童医院皮肤科门诊临床诊断为NGU患儿110例。其中女性患儿86例，男性患儿24例（2岁～12岁）。1997年9月～1998年6月北京市某医院男性科和妇产科106例NGU患者，其中女性62例，男性44例（21岁～60岁）。样品采集后放入含1mlSTE的Eppendorf管中，保存于-20℃。测定前融化样品，用1200r/min离心15min，弃上清，沉淀用50μl STE悬浮，煮沸10min，4℃保存供PCR检测用。上述全部样品均为淋球菌培养阴性。设正常对照81例，其中成人51例（女性31例，男性20例），儿童30例（男孩10例，女孩20例）。

1.2支原体标准菌株均由我所细菌研究室提供。

1.3支原体模板DNA提取方法参照文献^〔1〕

1.4引物和探针根据De BabeyracB^〔2〕等设计，扩增Mg-Pa基因。引物由美国Keystone Laboratories Inc合成。序列和基因位置：

MGS-1：5＇AAGCAACGTAGTAGCGTGAGC

3＇（112-132 bp）

MGS-4：5＇GTTGTTATCATACCTTCTGAT

3＇（388-408bp）

MGS-Ⅰ：5＇GAGCCTTTCTAACCGCTGC3＇（37-56bp）

1.5套式PCR反应第一次扩增：25μl反应体系中，含2.5μl × 10 Taq聚合酶缓冲液，200μMol／L dNTP，1μ Mol／L引物浓度（MGS1／MGS-4），1U Taq DNA聚合酶，10μl 模板DNA。94℃变性10 min，扩增反应采用：94℃变性，40s，60℃退火及72℃延伸各1 min，共做35个循环，最后在72℃延伸10min。第二次扩增1μ Mol／L引物（MGS4／MGS-Ⅰ），其它反应成份，浓度和反应条件均用于第一扩增，每次实验均设阳性和阴性对照。

1.6Mg-Pa扩增片段鉴定

1.6.1E.coRI酶切Mg-Pa扩增片段：10μl纯化后扩增产物，2μl 10 × E.coRI缓冲液，0.5U（5U／ml）E.coRI酶，1μl BSA（1mg／ml），加蒸馏水至总体积20μl，37℃2h，1.4％琼脂糖凝胶电泳。

1.6.2Mg-Pa扩增产物的斑点杂交^（3）：将40μl套式扩增产物固定于硝酸纤维素膜后，将杂交膜及30ml预杂交液（6×SSC，0.25％脱脂奶粉）封于杂交袋中，55℃预杂交2h。加入热变性的γ³²P ATP标记的MGS-1探针，55℃过夜。2 × SSC，0.1％ SDS室温下各洗膜两次，0.1 × SSC，0.1％ SDS 55℃洗膜2次。－70℃曝光5d，显影，定影，冲洗，晾干。

2结果

2.1PCR特异性与敏感性：MGS-1／MGS-4引物扩增Mg标准株，产生296bp扩增片段。MGS-I／MGS-4引物扩增Mg标准株，产生371bp长度的扩增片段。用E.coRI消化此扩增片段得到276bp与95bp。用γ32P-ATP标记的MGS-1寡核苷酸为内探针，与此扩增产物做杂交，结果为阳性，说明扩增产物为Mg-Pa粘附素的基因。以精氨酸支原体，口腔支原体，解脲脲原体，人型支原体，猪鼻支原体，发酵支原体，莱氏支原体，肺炎支原体和大肠杆菌为阴性对照，Mg与上述对照物进行扩增，均不存在交叉反应。检测Mg标准株粘附素基因的灵敏度为10³cfu／ml，10μl标本可检测出10 cfu Mg。

2.2正常人群与NGU患者中Mg检测的比较

2.2.1正常人群与NGU患者Mg检测比较在正常人群中Mg-DNA阳性率1.2％（1／81），NGU患者Mg-DNA检测阳性率7.8％（17／216）。两组进行比较具有显著性差异（x²＝3.985，P＜0.005）。

2.2.2成人和儿童NGU患者Mg检测比较成人NGU组Mg-DNA检测阳性率10.3％（11／106），儿童NGU组Mg-DNA检测阳性率5.4％（6／110）。但在统计学亦无显著性差异。

2.2.3性别之间Mg检测比较男性NGU组Mg-DNA检测阳性率10.2％（7／68），女性NGU组Mg-DNA检测阳性率6.7％（10／148），但在统计学亦无显著性差异。

3讨论

1981年Tully^〔4〕等首次从2名男性NGU患者的尿道试子中培养出Mg以来，人们对它的生物学特性和致病性进行了许多研究。由于Mg生长缓慢，特别在原代培养中，培养颜色改变仅在延长培养（35146天），培养基颜色才有变化，这对其临床研究带来了很大困难。现已知Mg的粘附素（Pa）是Mg的结构及功能蛋白，它位于菌体的顶部呈烧瓶状结构，它可粘附宿主生殖上皮细胞并与致病密切相关。选择该特定区域基因序列作为引物进行临床样品扩增，可成为Mg检测的方法。1987年，Hyman^（5）等首先用³²P标记的PPN4及PGN3探针，分别与Mg和Mp杂交，将两者区分。1988年Hooton^（6）等用全基因cDNA探针阐明了Mg在男性尿道炎中流行情况。直至1991年Palmer^（7）等建立PCR方法扩增了140kDa粘附素基因3端374bp基因片段。同年Jensen^（8）采用PCR方法扩增该粘附素5＇端281bp的基因片段。Mg在尿道炎患者中的存在，是寄居还是感染的致病因素之一，存在争论。Tully等^（9）给10只雄性黑猩猩尿道内接种Mg，8只出现尿道多形核白细胞炎症反应。7只检测出Mg，8只在接种后4～5周抗体滴度增加4倍或4倍以上。这些观察提示Mg可能是急性NGU的病原体之一。Jensen^（8）等用黄体酮处理雌性BABL／c小鼠，在由阴道内接种Mg做感染实验，PCR方法可检测出很高Mg的阳性率。在临床上Jensen^（8）等在急性NGU男性患者尿道样本中Mg阳性率为20％，慢性NGU阳性率17％，且Mg出现与尿道炎存在恰好重合，用红霉素治疗6周后，尿道炎恢复则检测不出Mg。Plamer^（7）发现在性传播疾门诊就医的妇女中，Mg阳性率20％。Blanchard^（10）等在NGU及非淋球菌性宫颈炎181例患者中，阳性率11.2％（12／14）。国内王自正等^（11）对我国部分地区高危人群Mg感染进行了调查。其Mg-DNA阳性率16.1％（82／511）。与正常人群1.8％（1／58）相比较具有高度显著性（x²＝7.882，P＜0.01）。本研究对216例临床诊断NUG患者标本进行了套式PCR法Mg-DNA检测，总阳性率7.8％（17／216）与正常人群1.2％（1／80）相比较同样具有显著性（x²＝3.985，P＜0.005）。与上述报道大体相同。该研究提示Mg是NGU病原体之一，在正常人群中可检测出Mg阳性率，说明有正常寄居的可能性。儿童NGU患儿中也存在Mg感染，其阳性率5.4％（6／110），应引起人们高度重视。

4参考文献

1.王正森，吴建新，赵小元等.用PCR法检测细胞培养中支原体污染.生物化学与生