摘要：建国50年来，病毒性肝炎的免疫学检测发展迅速，特别在1978年以后的几个五年计划期间，我国与发达国家同步，也开展了先进技术及试剂的研究，为病毒性肝炎的防治工作作出了应有的贡献。

一、甲型肝炎

1965年Deinhardt首先发现甲型肝炎可感染狨猴以后，1973年又分离出甲型肝炎病毒（HAV)，并确定其为单链RNA病毒。甲型肝炎发病早期，在粪便中通过免疫电镜及聚合酶链反应（PCR），可检出HAV颗粒及HAV RNA，而在血液中很难检出。患者血清中抗HAV IgM于发病数日的黄疸前期即可检出，急性期时达高峰，保持到12周后消失，为甲型肝炎的早期诊断提供了可靠方法。我国1982年首次采用抗人IgM重链(μ链)包被固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）抗体捕获法检测抗HAV IgM。但在试验中仍存在类风湿因子(RF)等引起的假阳性。经改用单克隆抗人μ链包被及抗HAV IgG F(ab)2的酶结合物，克服了干扰。

二、乙型肝炎

1965年Blumberg等发现了澳大利亚抗原，1973年确定为乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）后，为乙型肝炎提供了特异性免疫学诊断标志。有关检测研究受到普遍的重视。

1.表面抗原抗体和e抗原抗体的早期检测：(1) 国内在60年代末引入了免疫沉淀试验，开创了我国对乙型肝炎病毒抗原抗体的检测。我们先后采用过琼脂免疫扩散，对流免疫电泳，免疫放射电泳自显影等方法，但其特异性及敏感性还较差。(2) 间接免疫凝集试验：70年代初采用了一系列间接血凝试验(IHO)、免疫粘连血凝试验(IAHA)，乳胶凝集试验等，使检测的敏感性和特异性有所提高［1］。

2.核心抗体(抗HBc)的检测：抗HBc在HBV感染后可长期在血清中存在，对于流行病学调查、肝炎疫苗安全性鉴定等有重要意义。1978年我国应用区带密度梯度超速离心法，从尸检肝中大量纯化制备了核心抗原(HBcAg)，并免疫兔及豚鼠抗HBc血清［2］。与WHO提供的猴抗HBc血清有交叉免疫性，确认为HBcAg及抗HBc，精制的抗原达到免疫纯。国家卫生部药品和生物制品检定所推荐为国家首批参考标准品。相继建立了免疫粘连血凝及微量固相放免等方法检测抗HBc［3］，随后又建立了抗体捕获ELISA法，检测IgM、IgA及IgE型抗HBc，这些抗体与乙型肝炎的活动状况有一定相关性［4］。

三、丙型肝炎

1989年Choo等克隆出丙型肝炎病毒(HCV)cDNA，认为是输血后肝炎的主要病原。抗HCV及HCV RNA是检出HCV的主要指标。

1.抗HCV的检测：至今只能用人工合成多肽及基因工程表达的各种HCV片断，作为抗原来进行检测。国外已发展到第三代抗HCV酶免疫（EIA）试剂和重组免疫印迹(RIBA)试剂。我国于1991年开始了丙型肝炎试剂的研究，1992年合成了3个多肽［5］，1993年及1994年成功地表达了NS3区的HCV C33c抗原及NS5b蛋白［6］，研制了我国的第一代、第二代丙型肝炎试剂。1998年针对第三代进口试剂的状况，又研制出我国丙型肝炎诊断试剂的新一代国家参考品。改进国产试剂，达到了提高HCV NS3抗体检出率的同时，不降低对HCV核心抗体的检出力度的目的［7］。符合要求的新抗HBc诊断试剂已经投放市场。RIBA试剂随抗HCV EIA试剂发展，也推出了第三代试剂。RIBA大大降低了HCV EIA试剂在检测低危人群中所产生的假阳性率。

2.HCV RNA的检测：HCV在血中浓度极低，逆转录(RT)-PCR检测HCV RNA是目前唯一直接检查病毒血症的方法。1992年我国学者克隆出HCV基因全序列HC-BDS。经片段扩增及测序分析，确定了我国大多数HCV属基因Ⅱ型及Ⅲ型。由于HCV RNA基因的多变性，设计了HCV 5′非编码区(5′NCR)片段作为引物进行扩增，获得较高的阳性率。1995年采用生物素-补骨脂素(BP)标记引物建立逆转录原位PCR(RT-ISPCR)，提高了组织细胞内HCV RNA的检出率。

四、丁型肝炎

丁型肝炎病毒（HDV）作为一种缺陷性病毒常与HBV同时感染，或在感染HBV的基础上重叠感染。1992年，从我国HBsAg携带者血液中克隆了HDV cDNA，进行测序［8］，与从意大利、美国、日本等国家分离的HDV cDNA核苷酸同源性为86%～97.8%。主要通过ELISA检测HDAg及抗HDV进行临床诊断，抗HDV IgM是HDV感染的重要指标。

五、戊型肝炎

1989年Royers克隆戊型肝炎病毒（HEV） cDNA成功。其临床表现和传染特点与甲型肝炎类似。1992年我国学者克隆了新疆的流行株HEV CH1.1，并发现与XT-179有很高的同源性，与缅甸流行株的核苷酸同源性均很高，提示为同一亚型［9］。1997年国内用合成法制备了3个戊型肝炎多肽抗原，建立了ELISA方法检测抗HEV技术，与国外DBL公司生产的HEV检测试剂盒对比，检测效果良好。用RT-PCR可以检测血清、胆汁和粪便中的HEV RNA。

六、庚型肝炎及输血传播病毒（TTV）

1995年底Simons、1996年Linnen使用代表性差异分析技术(RDA)，分别报道了庚型肝炎病毒（HGV）的基因序列之后，时隔不到1年，于1996年底我国学者相继从1例供血者［10］及另1例肝炎患者血中完成了HGV cDNA全基因克隆及序列测定。应用RT-PCR及ELISA方法对HGV RNA及抗HGV进行了大量研究，确定了中国存在HGV，并初步揭示了感染及流行情况。

TT病毒是1997年10月Nishizawa等首次从输血后肝炎血液中克隆出来，1998年3月基因库释放了第一个TT基因，同年Okzmoto等克隆了TT全基因。我国1998年报告了TT全基因克隆及序列测定的结果。同年上半年我国领先报道了从一种新型肠传性病毒性肝炎患者的血清及粪便中提取DNA，经巢式PCR检出与TT有同源性的片段［11］。

七、抗体制备及检测技术进展

1.单克隆抗体及基因工程抗体的研究：我国于1983年建立分泌抗HBc IgM及IgG3的单克隆抗体的两个杂交瘤细胞系［12］。随后相继建立了分泌抗HBs、抗HBe、抗前S2及抗HAV等单克隆抗体杂交瘤细胞株。1996年制备出系列的抗HCV单克隆抗体［13］。这些都迅速运用于多种检测方法和制备试剂盒的研究，显著地提高了检测水平。

我国1994年研制了HBV前S2(HBV PreS2)基因工程单链抗体(ScFv)［14］。1995年又采用噬菌体抗体库技术，筛选到抗HBs单抗［15］。双功能抗体检测等新技术的研究也初见端倪。

2.固相放免(RIA)及EIA试验：80年代以来，随着单克隆抗体、人工合成多肽及基因工程表达抗原、各种标记技术的出现，一系列超微量免疫学检测的研究迅速发展。固相放射免疫测定(SPRIA)及ELISA试验广泛应用于微量可溶性抗原抗体的检测，也可用于固体组织免疫组化的检测，敏感度达到ng～fg/ml水平。由于ELISA具备保存时间长、无危害及污染、试剂稳定、可自动化检测等优点，得以迅速推广应用。目前ELISA检测各种肝炎病毒抗原抗体仍为较普遍应用的重要诊断条件。

3.胶体金免疫层析试验(GICA)：1997年采用胶体金标记Mc抗HBs，以硝酸纤维素膜为载体进行层析检测HBsAg的技术［16］，其特异性好，灵敏度可达1 ng/ml。可以避免在ELISA(特别是一步法)等方法中出现的由于抗原过剩所导致的钩状效应。其试剂稳定、易于保存，附有质控带可行质量监控，是适合基层单位检测肝炎病毒抗原抗体，操作简易快速、无须仪器设备的良好检测方法。

4.基因诊断：病毒核酸检测是肝炎病毒存在的最直接、最敏感、最特异的指标，早期采用斑点杂交等技术。1985年PCR出现，由于PCR技术具有高度的特异性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因而取代了斑点杂交、原位杂交、膜印迹杂交等基因检测技术，迅速广泛地用于肝炎病毒的检测研究。在实验技术上不断发展的套式PCR、原位PCR、链特异性PCR等也应用于体液及组织中肝炎病毒基因的检测［17］。1989年以来，我国对各型肝炎的诊断、发病机理、流行病学等进行了研究和报道。1997年运用PCR扩增片段限制性内切酶片段长度及基因序列分析，报告了我国HBV DNA变异的研究结果［18］。

八、体外诊断试剂质量控制和免疫学检测室间质评工作

国家卫生部从1988年开始，相继对乙型、甲型及丙型、戊型肝炎体外诊断试剂开展了质量控制工作。中国药品生物制品检定所组织协作，研制和提供诊断试剂的国家参考品，对试剂生产品种和生产厂家进行严格审批工作。从1993年开始，对肝炎诊断试剂的逐批产品进行检查，保证已批准生产的试剂质量稳定可靠；同时各级临床检验中心开展了室间质评工作，提高检测操作的水平，淘汰了一些敏感性低，特异性差、试剂难于标准化的检测方法，促进了检测工作整体水平的提高。

九、展望

建国以来，病毒性肝炎的免疫学检测从无到有迅速发展。进入90年代，由于分子生物学技术的提高和普及，信息交流的快捷，引进一些必需的试剂和仪器，为进一步提高免疫学检测的特异性、灵敏性、简便和自动化的水平提供了有利条件。

在酶联试验研究中开展的微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA)，进一步提高了检测的灵敏度，测定过程可以全部自动化。在PCR检测中，研究的Thermus嗜热菌DNA多聚酶的半定量PCR(Amplicor TM QPCR)和荧光定量PCR(FQ PCR)技术的发展，不但克服了污染等原因引起的假阳性和操作繁琐难于标化等缺陷，还提高了敏感性，有助于对病毒性肝炎的病程及治疗效果的观察。噬菌体随机肽库技术、DNA微阵技术、模拟表位及酵母双杂交系统的进一步研究，将促进HCV疫苗、基因疫苗和肝炎发病机理的研究进程。

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