中国医科大学学报2000年第29卷第2期

舒波李颖刘沛马殿玉王兆荃

摘要目的：调查重型病毒性肝炎经输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)的感染状况。方法：设计TTV基因的特异性引物，采用巢式PCR法对37例重型肝炎进行血清中TTV dNA的检测，并对TTV DNA阳性病例进行临床资料分析。结果：37例重型肝炎中9例血清TTV dNA阳性(24.3%)，其中7例重叠感染HBV，1例重叠感染HCV，1例为单纯TTV感染；9例中急性重型肝炎1例，亚急性重型肝炎6例，慢性重型肝炎2例；9例中5例死亡(55.6%)，1例有明确输血史。结论：TTV可在各型重型肝炎外周血中检出，TTV可能是导致重型肝炎和促进肝功能衰竭的重要因素之一。

关键词：输血传播病毒重型病毒性肝炎聚合酶链反应

1997年12月Nishizawa^［1］应用代表性差异分析法(RDA)首次从1例原因不明性输血后肝炎患者血清中分离到一种新的与病毒性肝炎相关的病毒基因，命名为输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)。TTV是一单股DNA病毒，基因序列长约3 700 bp，含有两个开放读码框，主要经输血传播^［1，2］。为调查重型肝炎TTV的感染状况，对37例重型肝炎血清进行了TTV dNA检测。

1材料与方法

1.1检测对象病例来源于1994年～1998年中国医科大学第二临床学院收治的重型肝炎37例。诊断标准依据1995年北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》。全部病例均检测甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒血清学，并应用PCR检测HBV dNA和HCV RNA。37例重型肝炎中男31例，女6例，年龄17岁～69岁，平均年龄(40.1±7.9)岁；其中乙型重型肝炎23例，丙型重型肝炎2例，戊型重型肝炎2例，乙丁重叠型重型肝炎1例，乙戊重叠型重型肝炎5例，非甲至非戊型重型肝炎4例；急性重型肝炎，亚急性重型肝炎和慢性重型肝炎分别为3例，23例和11例。

1.2引物合成和主要试剂根据Okamoto^［2］等报道的TTV基因序列，在TTV oRF₁保守区设计两对巢式引物，委托中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所合成，引物序列如下：P₁：5′-CACCAGGAGCATATACAGAC-3′；P₂：5′-GTAC-

tTCTTGCTGGTGAAAT-3′；P₃：5′-GACAGAGGAGAAGGCAACAT-3′；P₄：5′-TACTACTACCTCCTGG-3′；其中P₁、P₂为外引物，P₃、P₄为内引物，扩增产物为295 bp区带。Taq DNA聚合酶购自华美公司，dNTPs和φ174 Marker购自Promega公司。

1.3TTV DNA的检测无菌条件下采取静脉血5 ml，离心分离血清，分装，－70℃冰箱冻存，统一检测TTV dNA。以蛋白酶K法提取血清中病毒核酸。第1次PCR反应体系：模板4μl，P₁/P₂各1 μl，Taq酶2 u, 2 mmol/L dNTPs 3 μl，10×PCR缓冲液3μl，总反应体积30 μl；95℃ 3 min预变性后，依94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 50 s顺序，35个循环，最后延伸7 min。第2次PCR体系：第1次PCR反应产物3μl，P₃/P₄各1 μl，Taq酶2 u，2 mmol/L dNTPs 4 μl，10×PCR缓冲液3μl，总反应体积30 μl，循环参数同上。取第2次PCR反应产物10μl，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线检测仪下观察结果，出现295 bp DNA扩增带者为阳性。所有血清标本均按上述方法重复测试两次，如两次均为阳性，才判为血清TTV dNA阳性，每次实验均设阳性对照和阴性对照。

1.4数据处理采用χ²检验。

2结果

2.137例重型肝炎中9例TTV dNA阳性，阳性率为24.3%，其中男7例，女2例，平均年龄(41.0±3.5)岁。

2.23例急性重型肝炎，23例亚急性重型肝炎和11例慢性重型肝炎TTV dNA的检出率分别为33.3%(1/3)、26.1%(6/26)和18.2%(2/11)。

2.323例乙型重型肝炎，2例丙型重型肝炎和4例非甲至非戊型重型肝炎TTV dNA的检出率分别为30.4%(7/23)、50.0%(1/2)和25.0%(1/4)；而2例戊型重型肝炎，5例乙戊重叠型重型肝炎和1例乙丁重叠型重型肝炎均未检出TTV dNA。

2.49例TTV DNA阳性重型肝炎中5例死亡，病死率为55.6%，与28例TTV dNA阴性重型肝炎的病死率53.6%(15/28)相比，无显著性差异(P＜0.05)。

2.59例TTV DNA阳性重型肝炎中，仅1例有明确输血史。

3讨论

重型肝炎可由多种肝炎病毒引起，通常由甲型、乙型、丙型、丁型、和戊型肝炎病毒所致，但有一部分原因未明^［3］。1997年末Nishizawa^［1］等发现了一种新的可能与输血后肝炎和谷丙转氨酶(ALT)异常增高相关的病毒因子—TTV。日本学者Okamoto^［2］等报道非甲至非戊型重型肝炎TTV的感染率为47%，本组37例重型肝炎的TTV感染率为24.3%，且急性、亚急性和慢性重型肝炎血清中均检出TTV dNA。

重型肝炎时，病毒重叠感染和混合感染的发生率均较高^［3］，本组9例TTV感染的重型肝炎中8例重叠感染HBV和HCV，另1例为单纯TTV感染，表明TTV单纯或重叠它型肝炎病毒均可引起重型肝炎。TTV可能也是导致重型肝炎和促进肝功能衰竭的重要因素之一。

TTV最初从一名输血后肝炎血清中检出，故认为其主要经输血传播^［1，2］，骆抗先^［4］等在一组胃肠道传播的病毒性肝炎的流行中，自病人潜伏期的粪便中高比率检出与TTV相同的基因片段，认为TTV可能是一种肠传型肝炎病毒。本组9例TTV感染的重型肝炎1例有明确输血史，8例重叠感染HBV或HCV，提示TTV可能与HBV和HCV具有相同的感染途径。

9例TTV感染的重型肝炎的病死率为53.6%，与非TTV感染的重型肝炎的病死率相比，无明显区别。

舒波(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳110003)

李颖(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)

刘沛(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)

王兆荃(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)

马殿玉(沈阳242医院)

参考文献

1，Nishizawa T, okamoto H, Konishi K, et al. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem biophys Res Commun, 1997,24(1):92_97

2，Okamoto H, Nishizawa T, Kato N, et al. Molecular cloning and characterization of a novel DNA (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Hepatology Research, 1998,10(1):1_16

3，沈耕荣.重型肝炎.天津：天津科学技术出版社，1998.51～62

4，络抗生，章廉，王珊珊，等.一种新型肠传性病毒性肝炎的临床流行病学及病毒学的初步研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：161～163