中国医学科学院学报2000年第22卷第3期

赵阳青詹美云

摘要目的希望通过融合表达乙型肝炎病毒前S1抗原(preS1Ag)(1-42)及核心抗原(HBcAg)(1-144)提高预防性疫苗的细胞免疫活性，为开发HBV治疗性疫苗探索一条有效途径。方法采用PCR法获得在HBcAg(1-144)基因后连接有preS1Ag(1-42)基因的融合基因，然后将其插入表达载体pET-11d中，在大肠杆菌中进行表达。结果获得了HBcAg(1-144)与preS1Ag(1-42)融合蛋白的表达产物，SDS-PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为20 000左右，约占细菌总蛋白的20%。经Western-blot验证，表达产物能分别特异地与核心抗体及前S1抗体结合。经DNA序列测定，preS1Ag(1-42)基因正确地融合在HBcAg(1-144)基因之后。诱导表达的菌体的裂解液经免疫电镜观察，可见到成堆聚集的典型HBcAg颗粒。结论该融合蛋白的表达将为研究其诱导细胞免疫和体液免疫反应的能力，以及为今后治疗慢性乙型肝炎的T细胞疫苗的研制提供有用的资料。

关键词：乙型肝炎病毒前S1抗原乙型肝炎病毒核心抗原基因的融合表达

我国现有1000多万慢性肝炎患者，其中60%以上为慢性乙型肝炎。每年肝炎新发生病例200多万，20%左右为乙型肝炎患者，其中5%～10%转为慢性乙型肝炎。另外，我国还有1.2亿慢性乙型肝炎表面抗原携带者。因此研究提高患者的细胞免疫应答，打破机体的免疫耐受，对于消除乙肝病毒，治疗慢性乙型肝炎有着重要意义。乙型肝炎病毒前S1抗原含有B细胞和T细胞的抗原决定簇，并且参与乙肝病毒与肝细胞受体的结合^［1，2］，而核心抗原是一个很好的靶抗原^［3，4］，它可以带动前S1抗原的表达。本研究克隆了HBcAg(1-144)与preS1Ag(1-42)的融合基因，并在大肠杆菌体系中高效表达了该融合蛋白，为今后治疗慢性乙肝的T细胞疫苗的研制提供了有用的资料。

材料和方法

材料

菌株和质粒：大肠杆菌 Mc1061，BL21 为本室自备。含HBVayw基因的质粒pTHBV-1^［5］由本室保存。表达载体为质粒 pET-11 d，由本室自备。

试剂：各种限制性内切酶、连接酶、Vent 酶均购自华美生物试剂公司和New England Biolabs 公司，其它试剂均由北京化学试剂商店供应。

方法

质粒的提取，重组质粒的鉴定，DNA片段的回收及细菌转化技术：均按文献［6］方法。

PCR模板的制备：用NcoⅠ限制性内切酶作用于质粒pTHBV-1，可得到长度为3200及7400 bp的两个片断，回收包含HBV全部基因的3200 bp的片断作为模板。

PCR引物的设计：将NcoⅠ，BamHⅠ设计到扩增核心区的引物中，即：

c1：5′AGGCC^CATGGACATCGACCC 3′

NcoⅠ

c2：5′GGCG^GATCCCGGAAGTGTTGAT 3′

BamHⅠ

将BglⅡ，SmaⅠ设计到扩增preS1区的引物中，即：

s11：5′GATCA^GATCTATGGGGCAGAATC3′

BglⅡ

s12：5′CCTTCCC^GGGTTATGGCCAGGTGTC3′SmaⅠ

PCR法扩增DNA片段：PreS1(1-42)基因的扩增：以含HBVayw全部基因的3200 bp的回收片断为模板，以S11与S12为引物，反应体系为100 μl，含有100 pmol的引物，10 μl 10 X Vent酶缓冲液，8 μl 2.5 mmoL/L dNTPs，2 μl 100 mmol/L MgSO₄，30 ng左右的模板。95 ℃ 5 min后加lU的Vent酶，反应于PE公司的PCR自动反应仪，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 8 s，反应25个循环，最后于72 ℃延伸10 min，反应产物回收备用。Core(1-144)基因的扩增：除了以C1与C2为引物，延伸为72 ℃ 28 s以外，其它条件同前。Core与PreS1融合基因(简称CS1)的扩增：以Core的PCR产物经BamHl酶切与PreS1的PCR产物经BglⅡ酶切后的连接产物为模板，进行以C1与S12为引物的PCR，除模板和引物以及延伸为72 ℃ 30 s与以上两个反应不同外，其它同前。

CS1融合基因表达载体的构建：用BamHⅠ处理pET-11d载体，Klenow补平，再用NcoⅠ切出一粘性末端，回收后与CS1融合基因经NcoⅠ及SmaⅠ处理后的回收产物连接，转化大肠杆菌Mc1061，经酶切鉴定，挑选阳性克隆，转入BL21，以备表达使用。

外源基因在大肠杆菌中表达：含重组质粒pET-11 dCS1的大肠杆菌BL21于37℃在平皿中长出单斑后，转入2 ml左右Ap⁺的LB中，37 ℃培养，至对数生长期，用IPTG 37 ℃化学诱导2 h左右，离心收集菌体，超声波破碎菌体，再离心后的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，用考马斯亮蓝染色。

DNA序列测定由赛百盛公司完成。

融合蛋白的SDS-PAGE电泳及Western-blot 分析：按照文献［7］的方法，将SDS-PAGE胶分别电转于两张硝酸纤维素膜上。转移后的硝酸纤维素膜分别用HBc 单抗及pre-S1单抗为第一抗体，羊抗鼠的HRP标记的IgG为第二抗体，用四氯一萘酚为底物显色。

免疫电镜(IEM)观察表达产物形态：参照文献［8］方法。

结果

preS1(1-42)基因，Core(1-144)基因及CS1融合基因PCR产物鉴定经2.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴别，PCR产物条带分别在100～250 bp、250～500 bp、500～750 bp之间，与预计的126 bp、432 bp、558 bp片段大小相符(图1)。

CS1融合基因表达载体的构建与鉴定经酶切鉴定得到CS1/NcoⅠ/SmaⅠ 基因片段与pET-11d/BamHⅠ/Klenow/NcoⅠ载体片段连接而成的重组质粒pET-11dCS1(图2)。pET-11dCS1质粒用PstⅠ/EcoRⅠ，NcoⅠ/HindⅢ，PstⅠ/NcoⅠ，EcoRⅤ进行四组酶切，分别切出长度与预计大小相符合的片段(图3)。经DNA序列测定，结果显示preS1(1-42)基因正确地融合在Core(1-144)基因之后。

图1HBV preS1(1-42)基因，Core(1-144)基因及CS1融合基因的扩增产物

fig 1PCR amplified gene fragment of preS1(1-42)，Core(1-144)，and CS1

1.DL2000 marker；

2.PCR product of preS1(1-42) gene： 126 bp；

3.PCR product of Core(1-144) gene： 432 bp；

4.PCR product of fused CS1 gene：558 bp

图2重组质粒pET-11dCS1 构建示意图

fig 2Construction of recombinant plasmid pET-11dCS1

图3重组质粒pET-11dCS1的酶切鉴定结果

fig 3Identification of recombinant plasmid pET-11dCS1 by enzyme digestion

1.DL2000 marker；

2.pET-11dCS1 digested by PstⅠ/EcoRⅠ；

3.pET-11dCS1 digested by NcoⅠ/HindⅢ；

4.pET-11dCS1 digested by PstⅠ/NcoⅠ；

5.pET-11dCS1 digested by EcoRV；

6.λDNA/Hind Ⅲ+EcoR Ⅰmarker

图4融合表达蛋白的SDS-PAGE 分析和Western-blot 结果Fig 4SDS-PAGE and Western-blot of fussion protein CS1

1，5.protein molecular weight marker；

2，6.negative control；

3.Western-blot(with anti preS1 McAb)；

4.Western-blot(with anti Core McAb)；

7，8.SDS-PAGE of expressed fusion protein CS1

图5免疫电镜观察CS1融合蛋白

fig5Immune electron microscopy of E.coli-derived fusion protein CS1×31 000

a.E.coli-derived fusion protein CS1； b.human liver-derived HBcAg

CS1融合基因的表达表达产物经诱导后菌体出现相对分子质量为20 000左右的表达蛋白条带；不经诱导的菌体，无此条带。诱导产生的条带的大小与CS1融合蛋白相对分子质量相符。蛋白电泳凝胶经激光灰度扫描，融合蛋白表达量占菌体总蛋白的20%。

融合蛋白的SDS