第一军医大学学报1999年第19卷第4期

王虹王省良万成松彭华国张文炳

摘要目的：采用微板核酸杂交-ELISA技术测定肝炎病人血清中HBV DNA含量。方法：用PCR法将病人血清标本扩增后，与两条特异性探针夹心杂交，然后通过酶联显色对69例不同临床表现的肝炎患者血清中HBV DNA进行定量检测。结果：20例急性重型肝炎血清中的DNA含量超过2μg/L，88.24%的急性轻型肝炎患者和54.55%轻度慢性肝炎患者血清中的HBV DNA含量少于2μg/L，66.67%中度慢性肝炎患者血清HBV DNA含量在2～1000 μg/L的范围，75%重度慢性肝炎和45%急性重型肝炎血清中的HBV DNA含量超过1000μg/L。结论：微板核酸杂交-ELISA检测方法能准确、快速进行核酸定量测定，特异性强，灵敏度高，稳定可靠，易自动化，对于研究病毒感染量与临床病程的关系具有较大的现实意义。

关键词：微板核酸杂交ELISAHBV DNA定量

微板核酸杂交-ELISA定量检测技术将基因扩增、核酸杂交和酶联显色当今3种诊断技术融为一体，具有特异性强、灵敏性高、操作简单、易自动化等特点，在探讨乙型肝炎发病机理、动态监测病情进展和评价药物疗效等方面具有广泛的应用价值。本文介绍采用微板核酸杂交-ELISA技术对69例肝炎患者血清HBV DNA的定量测定与分析。

1 材料与方法

1.1 质粒与标本 质粒pHBV-C由本中心构建；69例乙型肝炎患者血清采自佛山市第一人民医院。

1.2 试剂和仪器 HBV微板核酸杂交－核酸定量试剂盒由本中心研制。PCR仪为美国伯乐公司产品，Taq 酶为上海复华公司产品，M750-B型多功能紫外可见光分光光度计为江苏泰州无线电仪器厂产品，550型酶标仪为BIO-RAD公司产品，生物素、TMB、Taq酶、辣根过氧化氢酶（HRP）购自宝灵曼公司、华粤公司。

1.3 杂交液主要配方 20×SSC、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、PEG、SDS等；洗液：1×SSC；封闭剂：1%Ficoll 400、1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、1%BSA、HS-DNA、脱脂奶粉、甘氨酸。以上溶液均由本中心自行配制。

1.4 引物与探针 采用Primer软件设计引物，选取HBV DNA C区的保守序列作引物与探针^[1]，由上海生工公司合成。其序列分别为：引物W1 TGGACGTCGCATGGAGACCACCGTGAA（1608-1634），引物W2 GAAAGCTTCTGCGACGCCG-TGATTGAGA (2429-2402），捕捉探针GATCCAGCATCCGCGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAACACCAACATGGGCCTAAAGATCAGGCAAC（2132-2198），信号探针 GGAATTAATGAC-TCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAG（1785-1845）。

1.5 标本处理 取上清液10μl加入990μl双蒸水于1.5 ml离心管内混匀。取自制处理液50μl于0.5ml离心管内，加待测血清50μl，100℃煮沸15 min，12000r/min离心5 min。

1.6 标准品的构建和定量 把HBV DNA C区基因克隆到质粒中，用大肠杆菌增殖，提取质粒DNA，用微量分光光度计测定质粒DNA浓度（100 mg/L）。采用极限稀释法^[2]，将核酸模板1:10倍比稀释，作32次循环的PCR，其阳性最大稀释度为1:10⁵ （相当于1 ng/L）。选择有一定差异的5个浓度：16、8、4、2、0.25 ng/L为横坐标，A_260nm值为纵坐标，作直线回归方程Y=aX+b，绘制标准曲线。

1.7 基因扩增 取标本上清液原液及其1:100倍比稀释液各4μl、5种浓度HBV DNA标准品各4μl和阴性对照4 μl于PCR反应管内，弹匀，上机，预变性94℃2min，循环条件：94℃50s、55℃50s、72℃50 s，共循环32次，最后72℃延伸3 min。

1.8 探针包被与封闭 在37 ℃下，用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）等将包被探针在微板孔上包被14h。用封闭剂封闭微板孔非特异性结合位点。

1.9 杂交 取扩增产物在94℃下变性10 min，迅速冰浴10 min。取已变性产物20 μl，杂交液90μl、显色探针10 μl（200 nmol）于反应孔内，轻轻摇动混匀，50℃杂交2 h，甩净液体。在每孔中加入洗液200 μl，置室温3～5 min，甩净，再重复洗二次。然后加入酶抗体100μl，37℃30 min后，甩净，加入洗液200 μl，置室温3～5 min，再重复洗两次。每孔加入底物TMB一滴，置室温8 min后加入2%硫酸溶液两滴终止反应。

1.10 结果判断 肉眼观察显黄色为阳性(+)，不显色为阴性(－)。选取每个阳性血清标本最大稀释度在酶标仪450nm处读数，并根据标准品标准曲线计算阳性标本的HBV DNA浓度（ng/L血清）。

2 结果

2.1 HBV DNA标准品极限稀释的A_260nm值结果和标准曲线 将HBV DNA标准品作极限稀释，核酸杂交显色的最大阳性稀释度为1:10⁵。选线形关系相对好的范围（相当于1～100 ng/L）作标准曲线，其相关系数r可达到0.994。结果如下：

图1 HBV DNA标准品极限稀释的A_260nm值结果

fig.1 Relation between A₂₆₀ and different Concentration of HBV DNA.1:10¹，2.1:10²，3.1:10³，4.1:10⁴，5.1:10⁵，6.1:10⁶，7.negative control，8.blank control

2.2 HBV DNA含量与肝炎临床病程的关系 我们对69例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量进行了测定，其中急性肝炎37例，慢性肝炎32例。结果如下：17例急性轻型肝炎患者中，15例患者血清中的HBV DNA含量小于2μg/L，2例介于2～1000μg/L之间；20例急性重型肝炎患者中，11例患者血清中的DNA含量介于2～1000 μg/L之间，9例超过1000μg/L。11例轻度慢性肝炎患者中，6例患者血清中的DNA含量小于2 μg/L，5例介于2～1000μg/L之间；9例中度慢性肝炎患者中，6例介于2～1000μg/L之间，3例超过1000μg/L；12例重度慢性肝炎患者中，3例介于2～1000μg/L之间，9例超过1000μg/L。

3 讨论

HBV呈世界范围流行，我国尤甚，其发病率高，治疗难度大，目前尚没有更好的方法能全面评价病毒感染量与临床病情的关系。血清中HBV DNA是病毒复制活动最直接和最可靠标志，HBV DNA定量检测能客观反映HBV滴度与临床病程的关系。

将基因扩增、核酸杂交和酶联显色当今3种诊断技术融为一体，发挥核酸杂交技术特异性强、PCR技术灵敏度高、ELISA方法信号判断方便的优点，发展了微板核酸杂交-ELISA技术。该方法不仅能对HBV DNA定性检测，而且能检测其含量。采用极限稀释法将核酸模板倍比稀释，构建标准品，选一定的线形范围作标准曲线，其相关系数(r)可达到0.994，其灵敏度最高可达到1ng/L。

采用微板核酸杂交-ELISA技术对69例不同临床表现的肝炎患者血清中的HBV DNA含量的测定表明，88.24%的急性轻型肝炎患者和54.55%轻度慢性肝炎患者血清HBV DNA含量少于2 μg/L,在66.67%中度慢性肝炎患者的HBV DNA含量分布2～1000μg/L范围，75%重度慢性肝炎和45%急性重型肝炎患者的HBV DNA含量分布在1000μg/L以上的范围。

作者简介：王虹,男,1958年出生,1982年毕业于中山医科大学,硕士,副教授,电话85147269作者单位：王虹王省良彭华国(第一军医大学生物医学诊断研究中心，广州，510515)

万成松张文炳(第一军医大学微生物学教研室，广州，510515)

参考文献

1 Ono Y，Ondo H，Sasada R et al. The complete nucleotide sequences of the cloned hepatitis B virus DNA subtype adr and adw. Nucleic Acids Res,1983,11:1747

2 Cross N. Quantitative PCR techniques and applications. Br J Heamatol,1995,89:693.