国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第2期

江苏省卫生防疫站(南京210009)俞晓进（综述）刘光中（审校）

重庆医科大学检验系 胡宏（审校）

摘要汉坦病毒属(Hantavirus，HV)至少包括6个血清型：汉滩病毒、汉城病毒、普马拉病毒、希望山病毒、泰国病毒和萦托帕拉亚病毒。本文综述汉坦病毒的基因组检测和基因分研究进展。

关键词：汉坦病毒 基因检测 基因分型

汉坦病毒属(Hantavirus，HV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的一个属，至少包括6个血清型病毒：汉滩病毒(Hantaan virus，HTN)、汉城病毒(Seroul Virus，SEO)、普马拉病毒(Puumala Virus pUU)、希望山病毒(Prospect Hill Virus，PH)、泰国病毒(Thailand Virus，THAI)和索托帕拉亚病毒(Thottapalaym，TMP)；最近的研究表明，引起汉坦病毒肺综合汉坦病毒属(Hantavirus pulmonary Syndrome，HPS)的病原体属于一种新的汉坦病毒。近年来，分子生物学技术飞速发展，使得汉坦病毒的研究得到了一次飞跃。本文综述近年来汉坦病毒的基因组检测和基因分型等方面的研究进展 。

1汉坦病毒的基因组特征

汉坦病毒是一种有包膜的负性单链RNA病毒，基因组分为大(L)、中(M)、小(S)3个节段。不同血清型汉坦病毒的S、M、L三个片段末段14个核苷酸序列高度保守，3'端为AUCAUCAUCUGAGG，5'端为UAGUAGUAG(G/A)CUCC，能形成柄状结构。

1.1S基因片段特征HTN病毒76-118株的S基因片段含糊9-696个核苷酸，有单一开放读码框架。从第37-39碱基(起始密码)到1322-1324碱基(终止密码)，编码429个氨基酸多肽，3'端与5'端22个碱基中20个互补，碱基组成：A26.7％、C23.8％、G19.2％和U(T)30.4％。与其他血清型病毒株如SEO、PUU及PH病毒S片段核苷酸及其推断的氨基酸序列比较，同源性很高(＞60％)，同源性主要在3'端与5'端，而中段缺少保守性。引起HPS的新型汉坦病SNV(sin nombre Virus，曾被称为Four Corners Virus和Muerto-canyon virus)经我国学者李德新研究发现^[1]：SNV的S基因片段由2047-2083个核苷酸组成，含1个1287个核苷酸组成的ORF，起始于5'端43位；与其他HV不同，S片段3'具有长的非编码区。S片段还含有一个192个核苷酸的潜在OFR，编码63个氨基酸的多肽，分子量约为7.6kD。PUU和PH病毒同样具有表达10-11kD蛋白的潜在编码区，而HTN、SEO病毒未发现类似的基因结构。

1.2M基因片段特征HTN病毒76-118株的M基因片段RNA含3616个核苷酸，其中A、G、C、U分别占29.8％、17.9％、21.4％、30.8％。在开放读码框架内，G1蛋白的编码起始于85-87位碱基，G2蛋白的编码起始于1985-1987位碱基，从第一个起始密码开始到3346-3348碱基结束，共编码1136个氨基酸，分子量约为126kD，RNA基因排列顺序为5'-G-G2-3'。G1蛋白起始于第19位氨基酸，止于588-614位。G2蛋白起始于第649位氨基酸，止于1127-1135位，分子量约64和54kD。同源性比较结果表明：同型商毒同源性很高，达95％左右；不同型病毒同源性，以汉滩病毒与汉城病毒，普马拉病毒与希望山病毒较高，分别为75％和76％，而前者与后者之间同源性较低，55％；不同毒株编码G1的核苷酸序列差别较大，估计是区别不同型糖蛋白抗原决定族所在。HTN病毒76-118株G1和G2上分别有5个和2个潜在与天门冬氨酸相连的糖基化位点。HPS病毒M基因片段RNA含3969个核苷酸，糖蛋白编码起始于第52位氨基酸，止于3467位，共编码1132个氨基酸，比76-118株少4个，比PH株少10个氨基酸，HPS的核苷酸序列的同源性与PUU和PH株较近，分别为66％和65％。而与HTN和SEO较远，而同源性只有58％。

1.3L基因片段特征HTN病毒76-118株的L基因片段的氨基酸，核苷酸序列分析资料表明，L基因片段长为6350-6550个核苷酸，编码2150-2156个氨基酸多肽，相当于24.6×100000大蛋白，病毒mRNA是一个单一长的开放读码框架，从36-39位氨基酸UAG(起始密码)到6490或6504位核苷酸后UAA(终止密码)。L片段较同种病毒的M和S片段更保守，不同毒株间同源性较高。如HTN与SEO和PUU比较核苷酸同源性分别为85％和70％。引起HPS的SNV的L片段序列与SEO、HTN、PUU病毒具有相似性，其中与PUU同源性最高，核苷酸水平71％相同，氨基酸U水平78％相同；Piiparinen^[2]发现PUU病毒两个位置存在与其它HTN病毒不同的保守序列。

2汉坦病毒的基因组检测

对汉坦病毒感染的诊断以均采用血清学，如间接免疫荧光(IFAT)检测IgG抗体，IgM抗体捕获法ELISA检测抗汉坦病毒IgM抗体，这些都是病毒感染的间接证据，且敏感性、特异性、早期诊断率有限，迅速发展的分子生物学技术为检测汉坦病毒提供了更为先进的方法。

Xiao^[3]用逆转录-PCR技术检测汉坦病毒基因并将之与常规病毒分离技术进行了比较，以逆转录-PCR技术可以从感染HTN76-118株和HV114VeroE6细胞中检测汉坦病毒RNA，而作为对照的培养物为阴性，感染HTN76-118的小鼠在5、8在和11天后均从肺、心、脑中检测出RNA，肝和脾在8天后也可测定出RNA，作者认为RT-PCR方法的敏感性与细胞培养相当，但更省时。Grankvist^[4]用逆转录-PCR技术对欧洲流行性肾病病人标本检测PUU病毒RNA，病人的尿道脱落细胞，支气管肺泡洗脱细胞及外周血单核细胞均可检测出RNA，将病人标本感染VeroE6细胞，培养9代共4个月，每一代均可测出RNA，Hijelle^[5]用逆转录-PCR技术检测汉坦病毒肺综合症(HPS)病人血液，从外周血单核细胞中检测出了病毒RNA；Kim^[6]根据HTN-76-118株和SR11株S基因组的核苷酸序列设计一套引物，该引物可同时检测汉滩病毒和汉城病毒组，使用套式PCR方法，对8例朝鲜病人进行了检测，发现发病一周内均扩增出特异的核苷酸片段，发病两周后，检测不出RNA；HoRlin^[7]同样用逆转录-PCR技术检测了病人标本的PUU病毒RNA，他所建立的方法检测限达10-5F/FU，可特异的检测出PUU rNA，而这些标本以ELISA法未测出病毒抗原，细胞培养也未获成功。邱建明对逆转录-套式PCR技术检测肾综合症出血病人HTN rNA，对137份汉滩病毒和汉城型HFRS病人血清分析，总阳性率达60.5％，病程在7日以内(急性期)的病人血清仍能检测出22.3％阳性率，扩增产物经打点杂交检测证实为特异的扩增。

3汉坦病毒的基因分型

汉坦病毒分型的方法有多种，最早采用的是空斑减少试验(PRNT)，PRNT特异性较好，是病毒分型的经典方法，但其试验要求严格，一般实验室难以开展；血凝抑制试验(HI)被用于汉坦病毒分型，但多项研究表明HI对有些毒株不能明确分型，单克隆抗体(McAb)分型被许多学者使用，但HV抗原体差异较大，有时仅凭少数株型特异性单抗难以区分其血清型甚至可能导致错误分型；放射免疫沉淀(RIP)和免疫印迹试验(Western-blotting)也被学者使用，但也有其局限。汉坦病毒不同血清型别间核苷酸序列差异较大，为该病毒应用分子生物学技术进行基因分型创造了条件。

汤一萎根据HTN76-118株和SEOR-22株M基因组G1区核苷酸序列设计了两对型特异引物及寡核苷酸探针，用RT-PCR对4株HTN血清型病毒和3株SEO血清型病毒进行了一对引物可成功地扩增除TMP以外的其他所有株病毒，用这对引物对基因扩增再用5种限制酶(AccⅠ、BanⅠ、BgⅢ、NocⅠ和NspⅠ)即可在琼脂糖凝胶电泳上将各毒株分为5种酶切型，据此将各毒株分为5个型别；Puthavathana^[9]根据汉坦病毒的S片段保守序列设计了一对属特异性引物可扩增来自5个大陆的27株汉坦病毒的特异片段，同时根据M基因组的特异性引物，分别用来扩增HTN、PUU和PH型病毒，分型结果与血清学结果一致；姚智彗使用该引物系统对我国不同来源的21株进行分型，除一株可同时被HTN和SEO型引物扩增外，其余只被HTN或SEO型引物扩增，分型结果与PRNT一致；Puthavathana^[10]在PCR分型的基础上对PCR扩增的产物进行测序，发现无论是来自何种宿主何种地区，HTN病毒和SEO病毒同源性为92％以上，PUU的同源性为80％～98％，核苷酸序列差异较大，但氨基酸比较保守。

为了更好地区分关系较为接近的病毒型别，迅速建立新毒株与已知毒株之间关系，Xiao^[11]使用了一种系统进化分析法(phylogenetic analysis)，原理是各种病毒与共同的祖先分歧的年代越远，在核苷酸分子中所积累的差异越大，所以来自不同病毒核苷酸序列的相似程度能反映出这些病毒之间的相似性和来源关系的远近，从而被用来重建这些病毒的分子发育系统。用一对M片段属特异性引物扩增一个333bp的特异片段，根据不同血清型病毒核苷酸序列差异构建了系统树，用这对引物对30株汉坦病毒进行RT-PCR扩增并对扩增产物进行系统分析，将这些病毒分为HTN、SEO、PUU、PH、THAI和DOB等6个型别，分型结果与血清学结果一致。梁米芳^[12]用这对引物系统对我国不同来源的15株病毒进行分析，构建的系统发生树表明：我国的HV主要是汉滩型和汉城型，汉滩型有3个基因亚型，汉城型有1个基因亚型。

Dekonenko^[13]对俄国不同地区的32株汉坦病毒和8份鼠肺标本进行了研究，方法有两种，一是套式PCR，另是一常规RT-PCR同时直接测序，构建了俄国领土上不同汉坦病毒的基因型分布构成模型。系统进化分析法被成功地运用到汉坦病毒肺综合症的研究中：李德新^[1]、Hjelle^[14]等用套式RT-PCR扩增SNV的M片段和S片段的核苷酸序列，测序后系统进化分析，确认SNV为汉坦病毒的一个新<