关键词： 纤溶酶原激活物抑制物-1；绿色荧光蛋白；基因表达；系膜细胞

【摘要】目的以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)为报告基因，构建纤溶酶原激活物抑制物-1（Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）与GFP融合基因的真核表达质粒，在活细胞状态下观察PAI-1/GFP融合蛋白在大鼠系膜细胞中表达 。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术，从含有编码人类PAI-1（hPAI-1）全长cDNA序列的质粒pUC19-PAI-1中扩增出hPAI-1的编码区全长 cDNA序列，定向克隆至真核表达载体pCMX-GFP。利用脂质体为转染载体，将表达质粒转染至体外培养的大鼠系膜细胞。利用Northern 杂交、Western 印迹、荧光显微镜直接观察以及纤维蛋白平板等方法检测PAI-1/GFP融合基因在大鼠系膜细胞的表达。结果 转染组大鼠系膜细胞PAI-1 mRNA表达、细胞培养上清PAI-1活性均较对照组明显增高。大鼠系膜细胞表达的融合蛋白PAI-1/GFP对尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）有明显的抑制活性，并能在荧光显微镜下激发绿色荧光。脂质体可以明显提高转染效率，24小时转染阳性细胞比例最高（33%±5.24%），与磷酸钙法（18%±3.21%）相比明显增高（P＜0.05）。其蛋白质表达从转染8小时后开始，24～48小时达到最高，表达时间可持续1周。结论PAI-1/GFP融合基因的真核表达载体首次获得成功构建，并在肾小球系膜细胞获得了表达。肾小球系膜细胞所表达的融合蛋白PAI-1/GFP具有PAI-1与GFP的双重活性，可在活细胞状态下利用荧光显微镜直接观察其表达情况。

Construction of PAI-1 /GFP fusion gene expression vector pCMX-GFP/PAI-1 and its expression in rat mesangial cells

YU Zhiheng, CHEN Xiangmei, LIAO Hongjun, et al. Department of Nephrology, General Hospital of PLA, Kidney Center of PLA, Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo construct PAI-1/GFP fusion gene eukaryotic expression vector pCMX- PAI-1-GFP and investigate PAI-1/GFP gene expression in rat mesangial cells.MethodsHuman PAI-1 cDNA was amplified from pUC19-PAI-1 by polymerase chain reaction method and inserted into mammalian expression plasmid pCMX-GFP. Using lipofectin method, the recombinant expression plasmid pCMX-PAI-1-GFP was transfected into rat mesangial cells.ResultsPAI-1/GFP gene was demonstrated by Northern blot analysis and Western blot analysis to be transcripted and translated in rat mesangial cells. PAI-1/GFP gene could express a specific protein. The recombinant PAI-1/GFP had significant inhibition activity to urokinase-type plasminogen activator and displayed autonomous fluorescence.ConclusionPAI-1/GFP fusion protein,expressed by rat mesangial cells shows a significant PAI-1 activity with fluorescence.

【Key words】Plasminogen activator inhibitor-1Green fluorescence proteinGene expressionMesangial cell

纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是人体纤溶系统中的重要调节因子，是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)的生理性抑制物^［1］。在血栓形成、细胞外基质积聚等许多病理生理过程中，PAI-1具有重要的调节作用。近年来，为了进一步阐明外源基因在肾脏疾病中的作用，越来越多的研究采用以肾脏为靶器官的基因转导，并依赖报告基因定位^［2］。目前常用的报告基因如lacZ,CAT,luc等编码的都是酶蛋白，需要底物或辅助因子参与才能检测活性，对细胞有一定损伤。1994年发现的绿色荧光蛋白（GFP）基因作为一种新型的报告基因引起了人们的极大关注^［3］。GFP是从水母中分离出来的一种发光蛋白，其编码区基因序列为714 bp，编码238个氨基酸。GFP表达后折叠环化，在氧存在的条件下，65～67位氨基酸残基环化（Ser-Tyr-Gly），形成发色团，可被450～490 nm的蓝光激发出绿色荧光。GFP对细胞无毒性作用，因而能在活细胞状态下检测。我们通过本研究旨在构建以gfp为报告基因的PAI-1表达质粒，转染阳性细胞并定位，从而在活细胞状态下观察融合基因在大鼠系膜细胞的表达，为下一步进行体内实验奠定工作基础。

材料与方法

一、主要材料

1．菌株、质粒和细胞株：大肠杆菌DH5α由本室保存，质粒pUC19-PAI-1为本室构建，质粒pCMX-GFP由日本九州大学的Ogawa教授惠赠。大鼠系膜细胞为本室培养。

2．试剂：各种限制性内切酶、工具酶及DNA测序试剂盒为美国Promega公司产品，总RNA提取试剂盒、pGEM-T Easy载体购自GIBCO公司，DOTAP转染试剂盒，随机引物标记试剂盒为宝灵曼公司产品，DNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司。纤维蛋白平板法测PAI-1活性的试剂均购自中国药品生物制品检定所。

二、试验方法

1．细胞的培养及转染：大鼠肾小球系膜细胞的培养和鉴定参照文献［4］。第3代肾小球系膜细胞在37℃、5% CO₂饱和湿度下用10% FCS-1640培养，转染前24小时细胞传代，换2%FCS-1640培养液。细胞密度为5×10⁵/25cm细胞培养瓶。取5μg质粒pCMX-PAI-1-GFP与30μg 脂质体混合，室温静置15分钟，加入25cm²细胞培养瓶。转染10小时后换10% FCS-1640培养液。

2．PAI-1/GFP融合基因真核表达载体的构建：以含有人类pai-1 （hpai-1）全长cDNA序列的质粒pUC19-PAI-1为模版PCR扩增hpai-1编码区cDNA。hpai-1上游引物：CAAGCTTATGCAGATGTCTCCAGCCCTC，

下游引物：CGGTACCACCACCGGGTTCCATCACTTGGC-CCAT。所扩增产物预计大小为1227bp，在其5’端加入HindIII酶切位点及起始密码ATG，3’端去掉终止密码TGA并加入Asp718酶切位点及编码3个柔性氨基酸的Linker序列。PCR反应体积为50 μl，扩增参数为94 ℃ 45秒，60℃45秒，72℃45秒。35个循环后行1%琼脂糖电泳分析。将测序证实的hpai-1 cDNA定向克隆至表达载体pCMX-GFP的Asp718、HindIII位点，hpai-1插入点位于gfp之前，并与gfp共用一套转录单元。pai-1与gfp之间由编码3个甘氨酸及2个苏氨酸的碱基链连接。

3．DNA测序：按Promega测序试剂盒说明书进行。

4．Northern 杂交：转染组及空质粒对照组在转染后24小时分别提取细胞总RNA。细胞总RNA用异硫酸胍一步法提取。随机引物法制备³²P标记的人pai-1 cDNA探针。20 μg总RNA用1%甲醛变性凝胶电泳分离后，转移到尼龙膜上，预杂交2小时后加入探针，杂交过夜。常规洗膜、压片、放射性自显影。

5．Western 印迹：转染组及空质粒对照组在转染后24小时分别提取细胞总蛋白。细胞总蛋白提取及Western印迹操作方法参照文献［5］。

6．转染效率的计算及表达持续时间的判定：转染组细胞经胰酶消化，上样于细胞记数板，在荧光显微镜下记细胞总数及发光细胞数。转染效率=发光细胞数/细胞总数×100%。转染后4、8、24、48、72、120、168小时分别计算转染效率。

7．PAI-1/GFP活性测定：转染后4、8、12、24、48、72、120小时在荧光倒置显微镜下用490 nm蓝光激发，观察PAI-1/GFP表达。取上述时间点无血清RPMI 1 640培养的细胞上清与等量的u-PA混合，25℃放置30分钟后，取30μl加在纤维蛋白平板上，37℃温育12小时。比较各组溶环面积，溶环面积缩小表示混合物总PA活性降低，即上清显示PAI活性利用u-PA 标准品绘制标准曲线，计算各点PA/PAI活性。

8．统计：采用Statistica统计软件进行统计学处理，结果以均数±标准差（±s）表示，对实验结果进行方差分析及配对t检验，P＜0.05为有统计学差异。

结果

一、hPAI-1 cDNA的扩增

以含有hpai-1全长cDNA序列的质粒pUC19-PAI-1为模版PCR扩增hpai-1编码区cDNA序列， PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体上，自动测序仪测序。所扩增的PCR产物为1227 bp，与预计大小相同，并与文献报道的pai-1 cDNA序列完全相同。它包含了完整的信号肽序列，其5’端加入了HindIII酶切位点及起始密码ATG，3’端去掉了终止密码TGA并加入了Asp718酶切位点及编码3个柔性氨基酸的Linker序列。

二、pCMX-PAI-1-GFP表达载体的构建

构建流程见图1。将测序证实的hpai-1 cDNA用Asp718及HindIII双酶从pGEM-T Easy载体中切下，定向克隆至表达载体pCMX-GFP的Asp718、HindIII位点，hpai-1 cDNA插入点位于gfp之前，并与gfp共用一套转录单元。pai-1与gfp之间由编码3个甘氨酸及2个苏氨酸的碱基链连接。经Asp718、HindIII双酶切证实有约1.2Kb的插入片段，并经酶切图谱证实，见图2。选用上述酶切位点保持了从pai-1起始密码到gfp终止密码的cDNA阅读框架，重组载体pCMX-PAI-1-GFP含有CMV启动子、完整的hpai-1 cDNA、gfp cDNA阅读框架和SV40polyA序列。