关键词： 表皮生长因子；维生素A；腹膜间皮细胞；细胞增殖；细胞分化

【摘要】目的研究表皮生长因子(EGF)和维生素A(Vit A)对高浓度葡萄糖抑制腹膜间皮细胞增殖和分化的影响，以探讨EGF和Vit A在腹膜修复中的作用。方法采用胰蛋白酶消化法，从人腹膜组织中分离间皮细胞，并建立体外人腹膜间皮细胞(HPMC)培养模型；以³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)掺入法测定细胞内DNA含量示细胞增殖程度；以免疫组织化学染色法，用图像分析仪测细胞表面角蛋白和波形蛋白(vimentin)表达量示细胞分化程度。结果随着葡萄糖浓度增高和培养时间的延长，HPMC ³ H-TdR掺入降低；EGF和Vit A可增加HPMC对³H-TdR的掺入，但两者cpm值比较无显著性差异(P＞0.05)；在含高浓度葡萄糖的培养液中分别加入EGF或Vit A后，EGF可明显促进HPMC的增殖，其³H-TdR掺入量明显增加，与Vit A组比较有显著性差异(P＜0.05)。EGF和Vit A不影响细胞表面角蛋白和波形蛋白的表达。结论EGF和Vit A对腹膜间皮细胞的分化未显示出明显作用，但两者均可刺激细胞的增殖，特别是EGF可改善高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞的增殖抑制作用，这对CAPD患者损伤腹膜的再生修复以及促进其功能恢复可能有重要意义。

Effects of epidermal growth factor and vitamin-A on proliferation and differentiation of human peritoneal mesothelial cells inhibited by high concentration glucose

ZANG Yan,LIU Hongfa,HOU Fanfan,et al.Department of Nephrology,Nanfang Hospital,Guangzhou 510515

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of EGF and VitA on the proliferation and differentiation of human peritoneal mesothelial cells(HPMC) inhibited by high concentration glucose and investigate their roles in the repair of peritoneal mesothelium.MethodsHPMC was separated with trypsin and the synthesis of DNA was measured by ³H-TdR incorporation.The expression of keratin and vimentin on the surface of HPMC were measured by immunohistochemistry staining.ResultsEGF and VitA didn't effect the expression of keratin and vimentin on the surface of HPMC.³H-TdR incorporation of HPMC cultured in the medium containing high concentration glucose was decreased significantly than in the RPMⅠ-1640 alone(P＜0.05). EGF and VitA both increased the ³H-TdR incorporation,showing no significant difference.But ³H-TdR incorporation of HPMC cultured in the medium with high concentration glucose and EGF was increased significantly(P＜0.05)than in the medium with high concentration glucose and VitA.ConclusionEGF and Vit A do not effect the differentiation of HPMC,but can ameliorate the inhibitive effect on proliferation of HPMC by high concentration glucose.It may play an important role in the repair of damaged mesothelium and restoration of its function.

【Key word】Epithelial growth factorVitamin APeritoneal mesothelial cellsCell proliferationCell differentiation

持续性不卧床腹膜透析(CAPD)时腹膜长时间浸浴在腹膜透析液中，腹透液含高浓度葡萄糖、高渗透压、低pH和乳酸盐等生物不相容性因素。临床研究显示^［1］，透析液进入腹腔后，透析液中的低pH值等在短时间内即迅速平衡，而葡萄糖的浓度可持续升高数小时。我们曾研究证实^［2］，持续存在的高浓度葡萄糖可抑制腹膜间皮细胞增殖，从而阻碍损伤腹膜的修复；同时也证实^［3］EGF有促进腹膜间皮细胞增殖的作用。但EGF能否影响HPMC的分化和高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞的增殖抑制作用，目前尚未见报道。EGF和Vit A是目前公认的上皮细胞分化和增殖因子。为此，我们采用体外人腹膜间皮细胞(HPMC)培养模型，研究EGF和VitA对腹膜间皮细胞分化和刺激增殖作用，及其对高浓度葡萄糖抑制腹膜间皮细胞增殖效应的影响，以探讨EGF和VitA在腹膜间皮细胞修复中的作用。

材料与方法

一、人腹膜间皮细胞的分离培养

按我们先前建立的方法操作^［2］。传代细胞经形态学和超微结构鉴定具有间皮细胞特征。免疫组织化学示抗细胞角蛋白、抗波形蛋白(vimentin)抗体(购自Dako公司)染色阳性；抗第Ⅷ因子相关抗原(购自Dako公司)和抗白细胞CD45抗原的抗体(购自北京军事医学科学院)染色阴性。

二、不同浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞增殖的影响

取第二代培养的HPMC，用RPMⅠ-1640(含5 mg/L转铁蛋白、1 mg/L氢化可的松、抗生素等，用前加入10%小牛血清)培养板调整细胞悬液浓度为1×10⁵／ml，加入96孔培养液中，每孔100 μl。设实验组葡萄糖终浓度分别0.5、1.0、1.5、2.5、4.25%，同时设一对照组(单纯RPMⅠ-1640培养)，放置37℃、5%CO₂培养箱中培养24、48、72小时，分别于培养结束前6小时加入³ H-TdR(胸腺嘧啶核苷，中国原子能科学研究院产品)，每孔0.5 μCi，培养结束后收集细胞，液闪仪测³H-TdR掺入量(用cpm值表示)。

三、EGF和VitA对腹膜间皮细胞增殖的影响

同上，取第二代培养的HPMC接种在96孔培养板上，分别加入不同浓度的EGF(5、10、20、50、100 ng/L)或 VitA(10^-8、10^-7、5×10^-7、10^-6、5×10^-6 mol/L)，每个因素组设一对照(单纯RPMⅠ-1640培养液)，于37℃、5%CO₂培养箱中共同培养24、48、72小时，在培养结束前6小时加入³H-TdR(胸腺嘧啶核苷，中国原子能科学研究院产品)，每孔0.5 μCi，培养结束后收集细胞，液闪仪测³H-TdR掺入量(用cpm值表示)。

四、EGF或VitA对不同浓度葡萄糖抑制腹膜间皮细胞增殖的影响

方法同上，将第二代HPMC接种在96孔培养板上。设两个不同因素实验组，即EGF加不同浓度葡萄糖组和VitA加不同浓度葡萄糖组；葡萄糖浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.5、4.25%，EGF终浓度为50 ng/L，

VitA终浓度为5×10^-6 md/L，同时设一对照组(单纯的RPMⅠ-1640加EGF或VitA，EGF和VitA的终浓度同上)。放置37℃、5%CO₂培养箱中培养72小时，于培养结束前6小时加入³H-TdR(胸腺嘧啶核苷，中国原子能科学研究院产品)，每孔0.5 μCi，培养结束后收集细胞，液闪仪测³H-TdR掺入量(用cpm值表示)。

五、EGF和VitA对腹膜间皮细胞分化的影响

取第二代HPMC接种在盖玻片上，放入培养皿中，分别加入含EGF(终浓度为50 ng/L)或VitA(终浓度为5×10^-6 mol/L)的培养液培养72小时，然后用抗细胞角蛋白抗体和抗vimentin抗体(均购自Dako公司)作为特异抗体，以ABC免疫组织化学染色。在Quantimet 520+型图像分析仪上进行分析，以每组100个细胞着色面积积分平均值表示HPMC表面相应抗原含量。

六、数据处理

全部数据采用BASE统计软件进行处理，结果以均数±标准差(±s)表示，对实验结果进行方差分析，配对t检验，P＜0.05为有统计学差异。

结果

一、不同浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞增殖的影响

HPMC与不同浓度葡萄糖共同培养24、48、72小时后，测其³H-TdR掺入量，结果显示，随着葡萄糖浓度的增高和培养时间的延长，³H-TdR掺入量降低(P＜0.05)，见图1。

图1人腹膜间皮细胞在不同培养条件下掺入³H-TdR的变化

二、EGF和VitA对腹膜间皮细胞增殖的影响

用EGF或VitA分别与HPMC培养24、48、72小时，测其³H-TdR掺入量，结果表明，EGF和VitA均能增加HPMC对³H-TdR的掺入，并且HPMC的增殖与EGF和VitA呈剂量依赖，其中EGF的最大刺激增殖剂量为50 ng/L、VitA为5×10^-6mol/L，见图2，3。两者比较EGF刺激HPMC后的³H-TdR掺入量略高于VitA，但无显著性差异(P＞0.05)。

图2不同浓度EGF和培养时间对腹膜间皮细胞增殖的影响

图3不同浓度VitA和培养<