关键词： 糖尿病肾病；苯那普利；血小板衍化生长因子－B；血小板衍化生长因子－β受体

【摘要】目的探讨血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)苯那普利对单侧肾切除糖尿病大鼠肾皮质血小板衍化生长因子-B(PDGF-B)及其β受体表达的影响。方法苯那普利(10mg^．kg^-1．d^-1灌胃)治疗4周后应用荧光分光光度法检测各组血浆和肾皮、髓质ACE活性；用免疫组织化学方法检测肾皮质Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)及PDGF-B蛋白表达；用Northern和Western杂交检测肾皮质PDGF-B mRNA及细胞膜PDGF-β受体蛋白表达。结果苯那普利能降低糖尿病大鼠血肌酐、相对肾重及肾皮质ACE活性。免疫组织化学结果提示苯那普利可抑制糖尿病肾皮质肾小球及肾小管Ⅳ型胶原、FN及PDGF-B蛋白高表达；Northern杂交表明肾皮质PDGF-B mRNA表达比对照组增加近3倍，Western杂交证实肾皮质细胞膜PDGF-β受体蛋白表达比对照组增加近1.5倍。苯那普利对肾皮质PDGF-B mRNA表达无明显影响，但它可明显抑制肾皮质细胞膜PDGF-β受体蛋白高表达。结论苯那普利对糖尿病大鼠肾脏保护作用至少部分与抑制PDGF-B及其β受体蛋白表达有关。

Effects of Benazepril on the expression of platelet derived growth factor PDGF-B chain and its β receptor in diabetic rat renal cortex

YU Yi, WU Yonggui, LIN Shanyan, et al. Division of Nephrology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040

【Abstract】ObjectiveTo investigate effects of Benazepril on the expression of PDGF-B chain and its β receptor in diabetic rat renal cortex.Methods 20 rats were divided into control group (C),diabetic group(D) and diabetic+Benazepril group(DB).After 4 weeks of Benazepril treatment, ACE activities of plasma, renal cortex and medulla,were detected by fluorimetric assay; the expression of type Ⅳ collagen , fibronectin (FN) and PDGF-B chain protein were determined by immunohistochemistry in renal cortex, and the expression of PDGF-B chain mRNA and PDGF-β receptor protein were measured by Northern and Western blot analysis in renal cortex and its cell membrane, respectively.ResultsBenazepril could decreased elevated serum creatinine lever，relative kidney weight and ACE activities in diabetic rats renal cortex. Immunohistochemistry showed that Benazepril could prevent overexpression of type Ⅳ collagen, FN and PDGF-B chain protein within glomeruli and tubule of diabetic rats renal cortex.Compared with C group,the expression of PDGF-B chain mRNA increased by 3.0 folds in renal cortex of D group from Northern blot and the expression of PDGF-β receptor protein increased by 1.5 folds in cell membrane of renal cortex of D group from Western blot. Benazepril treatment had no effect on overexpression of PDGF-B chain mRNA in diabetic rats renal cortex, however, it could significantly reduce increased expression of PDGF-β receptor in cell membrane of diabetic rats renal cortex.ConclusionThe protection of benazepril against kidney was associated, at least in part, with down-regulating overexpression of PDGF-B chain and PDGF-β receptor protein in diabetic rats kidney cortex.

【Key words】Diabetic nephropathyBenazeprilPlatelet derived growth factor-B chainPlatelet derived growth factor-β receptor

近年来，大量的实验和临床研究证实ACEI对糖尿病肾病(DN)具有肯定的保护作用，其作用机制除血流动力学效应外，更重要的是抑制肾组织转化生长因子β(TGFβ)及其受体表达^［1，2］。事实上DN发病过程中肾组织过高糖负荷可诱导多种生长因子表达，而ACEI对糖尿病肾组织病理改善程度并不与抑制TGFβ表达完全一致。因此，我们在以前研究的基础上进一步探讨ACEI对DN发病时PDGF系统的影响。PDGF由PDGF-A和PDGF-B两型组成，其受体包括α和β两亚型。目前对PDGF-A作用机制尚不十分清楚，PDGF-B的作用只能由β受体介导^［3］。本研究中，我们仅观察苯那普利对糖尿病大鼠肾组织PDGF-B及β受体表达的影响。

资料与方法

一、糖尿病动物模型的建立

雄性成年Wistar大鼠20只(上海计划生育研究所)，体重180～200 g，均接受右侧肾切除术，2周后腹腔单剂量注射STZ 60 mg/kg(溶解于10 mmol/L枸橼酸缓冲液中，pH 5.5)制成糖尿病模型(n=14)，对照组(C组，n=6)仅注射等量枸橼酸缓冲液。取一半糖尿病大鼠给予苯那普利(诺华制药有限公司)10 mg^．kg^-1．d^-1灌胃(DB组，n=7)，其余为D组，n=7，仅给予等量自来水灌胃。整个实验期间大鼠均喂标准饮食，亦不使用胰岛素。观察4周后大鼠在3%水合氯醛麻醉下行右侧颈总动脉插管收集血标本待测血糖、血胰岛素、血肌酐及血ACE活性；肾脏在腹主动脉插管后予4℃预冷的生理盐水反复灌洗后，称重，分离皮、髓质，取一半肾皮质以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成4 μm切片;另一半液氮冻透后保存于-70℃备用。

二、观察指标及方法

1.常规生化指标：血糖、血肌酐由日立7150型全自动生化分析仪测定；血胰岛素采用放射免疫法( 试剂盒购自中国原子能科学同位素研究所)。

2.血浆及肾皮、髓质ACE活性：参考Unger等^［4］方法，由日立F-4000荧光分光光度计测定，EX 360 nm,EW 486 nm。所需试剂马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu)、邻苯二醛(0-phthadialdehyde)及组氨酰-亮氨酸(His-Leu,HL)均购自Sigma公司。

3.免疫组织化学：采用卵白素-生物素复合物(ABC)技术。切片常规脱蜡、水化。1%过氧化氢甲醇液灭活内源性过氧化物酶，0.2%胃蛋白酶溶液(Ⅳ胶原、纤维连接蛋白)或1 mg/ml 透明质酸溶液(溶于0.1 mol/L醋酸钠溶液，PDGF-B)，37℃消化1小时。1∶20正常羊血清封闭非特异性染色。分别滴加兔抗Ⅳ胶原(1∶200，上海医科大学病理教研室)、兔抗纤维连接蛋白(1∶150,Dako公司)及兔抗PDGF-B(1∶50，Santa Cruza公司)，37℃孵育1小时，4℃过夜。滴加生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200,华美生物试剂公司)，37℃孵育1小时，滴加ABC复合物(1∶100∶1,华美生物试剂公司)，37℃孵育45分钟。滴加DAB-H₂O₂显色液，显微镜下控制显色，然后苏木素复染细胞核。常规脱水、透明、封片。上述各步骤间均以TBS缓冲液冲洗。实验均同时采用正常兔血清和删除第一抗体方法作为阴性对照。结果在高倍镜（200×）下随机选择20个肾小球和20个视野肾小管-间质,根据染色面积和强度按下列方法进行半定量评分：0=无染色或微弱染色；1=染色面积小于25%； 2=染色面积在25%～50%之间；3=染色面积在50%～75%之间； 4=染色面积大于75%。

4.Northern杂交分析：采用异硫氰酸胍一步法提取肾皮质总RNA，取30 μg在质量分数1.0%甲醛变性凝胶电泳后转移到尼龙膜上并行UV交联固定，42℃预杂交过夜，PDGF-B探针为870 bp(美国华盛顿大学Mahaoka博士惠赠)，用随机引物标记试剂盒进行放射性标记。α-³²P-dCTP购自北京辉瑞公司。尼龙膜在42℃杂交24小时，洗膜后置－70℃曝光，然后进行放射自显影分析。所有样膜经洗脱探针后再次用β-actin探针(870 bp)进行杂交，为内在点样控制。最后用IBAS-2000图像分析系统对全部杂交信号进行吸光度A分析。

5.Western杂交分析： 肾皮质细胞膜参考Tsao等^［5］方法制备。膜蛋白浓度按改良Lowry法测定。取膜蛋白50 μg在质量分数15% SDS-PAGE凝胶电泳,然后转移至硝酸纤维素膜(斯巴斯公司)上，用丽春红染色观察转移效果并标出分子量标准，然后用含5%脱脂牛奶TBST封闭，4℃过夜，洗膜后用免抗大鼠PDGF-β受体多克隆抗体(Santa Cruza公司，工作浓度1∶200)进行杂交，再用HRP标记的羊抗兔IgG(华美生物工程公司，工作浓度1∶200)进行二抗杂交, 加ECL试剂(华美生物工程公司)后进行放射自显影。最后，所有杂交信号在IBAS-2000图像分析系统中进行吸光度分析。

三、统计学处理

数据以均数±标准差(±s)或中位数表示，组间差异性比较采用方差分析及q检验，免疫组织化学半定量评分采用秩和检验。

结果

一、各组血糖、血胰岛素、血肌酐水平及相对肾重的变化

与对照组(C组)相比，糖尿病(D组)大鼠血肌酐水平已有所上升(P＜0.05)，相对肾重亦有所增加(P＜0.05)，苯那普利治疗后，DB组血肌酐、血糖和相对肾重均比D组有所降低，见表1。

表1各组血糖、血胰岛素、血肌酐水平及相对肾重的变化(±s)