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【摘要】目的探讨在体外条件下马兜铃酸I(AAI)能否诱导肾小管上皮细胞发生凋亡及发生凋亡的条件。方法应用光镜、琼脂糖凝胶电泳、Annexin-V-Flous凋亡检测试剂盒鉴定细胞凋亡，应用流式细胞仪测定凋亡细胞比例。结果0.02 g/L，0.04 g/L，0.08 g/L的AAI作用24小时可明显诱导LLC-PK1细胞凋亡，0.01 g/L的AAI无此作用。随AAI浓度的增高，凋亡细胞比例增加。结论在体外条件下一定浓度的AAI能诱导LLC-PK1细胞发生凋亡，其作用与浓度有关。
Aristolochic acid I-induced apoptosis in LLC-PK1 cells.
GAO Ruitong, ZHENG Falei,LIU Yanxin,et al. Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Beijing 100730
【Abstract】ObjectiveTo examine the effect of different concentrations of AAI in inducing apoptosis of the cultured porcine renal cell line LLC-PK1.MethodsLLC-PK1 cells were treated in different groups : a. normal, without treatment; b. with AAI (0.01g/L, 0.02g/L，0.04g/L，0.08g/L). Light microscopy, agarose gel electrophoresis, Annexin-V-Flous apoptosis detection kit and flow cytometry using propidium iodiode staining were used to identify or quantify the apoptosis of LLC-PK1 cells.ResultsIn AAI treated groups(0.02g/L～0.08g/L), LLC-PK1 cells membrane blebing, apoptotic bodies,Annexin-V-Flous staining positive apoptotic cells and “DNA ladder” were identified. However no difference was found except growth inhibition when cells in 0.01g/L AAI treated group were compared to that in normal group. Quantitative analysis of apoptotic cells showed that the apoptotic cells ratio in 0.02g/L，0.04g/L or 0.08g/L AAI group was significantly higher than that in normal group(5.3%, 48.5%, 78.7%vs 2.6%, P＜0.001),and the ratio increased in AAI concentration-dependent manner(P＜0.001).ConclusionHigh concentrations of AAI may induce LLC-PK1 apoptosis,and the apoptotic cells ratio increased in AAI concentration-depedent manner.
【Key words】ApoptosisLLC-PK1 cellsAristolochic acid
近十几年来的研究表明，肾间质纤维化的发生和发展在慢性肾功能衰竭的发展中起着关键作用［1，2］。不仅慢性肾小管-间质病变，而且中晚期肾小球病变中都有广泛肾间质纤维化存在。因此关于肾间质纤维化的研究受到许多肾脏病学者的高度重视。近年来国外文献报道个别中草药或减肥药可引起肾功能损害，主要表现为急性进展性肾间质纤维化(rapidly progressed renal interstitial fibrosis)，并将此类肾病称为所谓“中草药肾病”(“Chinese herbs nephropathy”)［3，4］。据初步研究，此类肾病主要由马兜铃酸(aristolochic acid,AA)的肾脏毒性作用所引起，因此我们认为应将此类肾病称为马兜铃酸肾病(AA nephropathy,AAN)。由于AAN是一种表现较特殊的肾间质纤维化，比一般慢性间质性肾炎进展迅速，一年或数年内即可发展为终末期肾功能衰竭，危害较大，因此研究其发生机制及相应的防治方法很有必要，对提高肾间质纤维化和慢性肾功能衰竭的防治水平有其重要意义。目前关于AAN机制的研究报告极少。我们的动物实验结果初步表明，马兜铃酸所致的急性和慢性肾功能损害均可能与细胞凋亡有关［5］。国内外文献中尚未发现有关AA肾毒性的体外试验研究报告发表。我们对马兜铃酸I(AAI)能否诱导猪肾小管上皮细胞系LLC-PK1细胞凋亡首先进行了探讨，并对AAI引起细胞凋亡的意义进行了讨论，并对AAI引起细胞凋亡的意义进行了讨论。
材料和方法
一、LLC-PK1细胞系
来自中国医学科学院基础医学研究所分子生物学国家重点实验室。
二、试剂和仪器
AAI纯品(北京生物制品研究所)，Annexin-V-Flous apoptosis detection kit(Boehringer Mannheim公司)。荧光显微镜(Nikon)，流式细胞仪(FACS420型，Becton-Dickinson公司)。
三、方法
1.LLC-PK1细胞的培养：LLC-PK1细胞用含10%胎牛血清及1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPM 1640培养基(10%FCS RPMI 1640)传代培养，培养条件为37℃，5%CO2。
2.AAI母液：准确称量AAI，搅拌溶于10%FCS RPMI 1640使AAI浓度为0.08 g*1-1，0.22 μm滤纸滤过灭菌，分装。不同浓度的AAI由AAI母液与10%FCS 1640混合而得。
3.实验分组：LLC-PK1细胞传代24小时后，弃去原培养基，作如下分组：(1)对照组：只加10% FCS RPMI 1640。(2)AAI组：使AAI终浓度分别为0.01 g/L，0.02 g/L，0.04 g/L，0.08 g/L。
4.形态学观察：分组处理后，每隔4小时观察细胞形态学改变，24小时后于倒置显微镜下观察并照相。
5.Annexin-V-Flous凋亡检测试剂盒检测：消化并收集细胞，弃培养基，PBS洗2次，加入Annexin-V-Flous凋亡检测混合液，避光室温下染色10～15分钟，荧光显微镜下观察，照相。
6.DNA片段化鉴定：分组处理24小时后收集细胞并提取总DNA，方法如下：(1)1500 r/min离心10分钟后，分别收获各组飘浮的细胞和用消化液(含
1∶250胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化的细胞。(2)PBS洗2次，3000 r/min离心3分钟。(3)加入裂解液300 μl/107细胞,充分混匀10分钟，置冰上15分钟后12 000 r/min离心5分钟。(裂解液配方：50 mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，1% NP-40)(4)收集上清，加等体积饱和酚，颠倒混匀3分钟，抽提一次，12 000 r/min离心5分钟，取上清。(5)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(24∶24∶1)，颠倒混匀3分钟，抽提一次，12 000 r/min离心5分钟，取上清。(6)加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀3分钟，抽提一次，12 000 r/min离心5分钟，取上清。(7)加入1/4体积10 mol/L NaAc(pH 5.2)和等体积异丙醇，-20℃置30分钟，12 000 r/min离心20分钟，小心吸去上清。(8)1 ml冰预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心5分钟，晾干。加15 μl TE及RNase(终浓度为50 mg/L)，溶解后于56℃消化2小时。(9)于1.8%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 mg/L)，以5 v/cm电压降电泳2～3小时。紫外灯下分析并照相。
7.流式细胞仪检测：分组处理24小时后，行如下处理：(1)1500 r/min离心10分钟，收获各组飘浮的细胞和用消化液消化液消化的细胞(约1×106细胞)。(2)去上清，PBS洗2次，1500 r/min离5分钟。(3)去上清，回流液悬浮沉淀，反复轻吹使细胞分散成单个，加入足量冰预冷的70%乙醇混匀，4℃固定3小时以上。(4)1500 r/min离心5分钟，去上清，加入PBS洗2次，1500 r/min离心2分钟。(5)去上清回流液约0.3～0.5 ml混匀细胞。(6)加入RNase(终浓度50 mg/L)，37℃消化1小时。(7)加入碘化丙啶(PI，终浓度为50 mg/L)。(8)200目尼龙网过滤。(9)流式细胞仪分析。
四、统计方法
组间凋亡细胞比例的比较用卡方检验。P＜0.05表示有统计学上的显著差异。
结果
一、形态学观察
正常LLC-PK1细胞为棱形或梭形贴壁细胞。AAI浓度为0.02～0.08 g/L时，加药24小时内都可观察到明显的细胞凋亡发生，其表现为：细胞轮廓逐渐清晰，细胞折光度增强，棱形或梭形的紧密贴壁细胞渐变小，变圆，可见细胞膜发泡现象，然后细胞脱落或悬浮，最后可形成凋亡小体。AAI浓度越高，细胞出现凋亡越早，同一时间的凋亡细胞比例越高。AAI浓度为0.08 g/L，0.04 g/L，0.02 g/L时最早可观察到细胞发生凋亡的时间 6小时，8小时，12小时。AAI浓度为0.01 g/L时，加药24小时内细胞形态与正常细胞相比未能观察到明显差别。
二、Annexin-V-Flous凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞
加AAI(0.04 g/L)24小时后，发生凋亡的LLC-PK1细胞于细胞膜位置出现绿色荧光，细胞核位置无红色荧光。对照组未观察到绿色或红色荧光(图1)。
三、琼脂糖电泳
AAI组(0.02 g/L,0.04 g/L,0.08 g/L)呈现DNA梯形带(DNA ladder)，浓度为0.01 g/L的AAI组与对照组DNA在加样孔附近，为基因组DNA表现，无DNA ladder出现(图2)。
图2DNA电泳结果a.DNA marker。b.对照组。c～e.AAI组(浓度依次为0.08 g/L，0.04 g/L，0.02 g/L)，呈典型的DNA梯形带(DNA ladder)。f.AAI组(0.01 g/L)，DNA集中于基因组位置，无DNA ladder。
