关键词： 肾小球；内皮细胞；单核细胞；单核细胞趋化蛋白-1

【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)对培养的人肾小球内皮细胞(HUGEC)表达单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响以及HUGEC的条件培养基对单核细胞(MC)的趋化作用及抗MCP-1抗体对单核细胞迁移的影响。方法(1)采用原位杂交技术、免疫细胞化学、细胞ELISA法观察MCP-1基因及蛋白表达。(2)用改良的Boyden小室微孔滤膜法测定TNFα刺激HCGEC后的条件培养基对MC的趋化作用及抗MCP-1抗体对MC迁移的影响。结果(1)在不加刺激条件下培养的HUGEC弱表达MCP-1基因及蛋白，50 ng/ml TNFα刺激后，6小时即有MCP-1蛋白表达增强，于12小时达高峰，不同浓度的TNFα(25、50、100ng/ml)刺激HUGEC 6小时后，与正常对照组相比差异显著(P＜0.01)。(2)TNFα刺激HUGEC后的条件培养基对MC有明显趋化作用，并被抗MCP-1抗体抑制。结论HUGEC在TNFα诱导下，其MCP-1的表达增强，其条件培养基对MC有趋化作用，从而可能招引单核细胞迁入内皮下间隙。

Expression of monocyte chemoattractant protein-1 in glomerular endothelial cells

DING Hanlu^*, ZHU Miaozhen, LUO Xiangdong ,et al. ^*Department of Nephrology, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in cultured human glomerular endothelial cell (HUGEC).MethodsThe effect of TNFα on the expression of MCP-1 mRNA and protein by HUGEC was observed with in situ hybridization, immunocytochemistry, cell ELISA analysis . The monocyte migration induced by the media conditioned by cultured HUGEC was assayed by micropore filter method using modified Boyden Chamber. Influence of anti-MCP-1 antibody on monocyte migration was observed as well.ResultsmRNA and protein of MCP-1 were only basically expressed on HUGEC at very low levels in the control groups without stimulation. After stimulation by TNFα (50ng/ml), however, their expression was markedly upregulated from the 6th hour. The maximal protein expression of MCP-1 was present at the 12th hour. Compared with control groups, MCP-1 protein expression was significantly increased after the stimulation at different concentration of TNFα (25,50,100ng/ml) stimulation (P＜0.01). HUGEC stimulated by TNFα produced a factor that was markedly chemotactic for monocytes , and the chemotactic activity was inhibited by anti -MCP-1 antibody.ConclusionHUGEC stimulated by TNFα may highly express MCP-1, and produce chemotactic factors for monocytes.

【Key words】GlomerulusEndothelial cellMonocyteMonocyte chemoattractant protein-1

在肾小球肾炎的发生发展过程中，外周血单核细胞(Monocyte MC)浸润于肾小球间质具有极为重要的意义，但其浸润机制不太明确。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是新近被确认的具有对单核/巨噬细胞趋化、激活作用的趋化因子^［1］。肾小球内皮细胞(HUGEC)直接暴露于血中循环因素，是MC穿越的第一道屏障，在TNFα作用下，HUGEC能否表达MCP-1，其条件培养基对MC是否有趋化作用，尚未见报道。我们采用原位杂交、免疫细胞化学、细胞ELISA方法观察TNFα对HUGEC表达MCP-1基因及蛋白的影响，用改良Boyden小室微孔滤膜法观察HUGEC条件培养基对MC的趋化作用及抗MCP-1抗体对单核细胞迁移的影响，旨在探讨HUGEC在TNFα作用下是否增强MCP-1表达，并发生对MC的趋化作用，以闸明MCP-1在肾小球肾炎发生中的作用。

材料和方法

一、人肾小球内皮细胞的培养和鉴定

按参考文献［2］，用无菌Hank液冲净表面血迹，剥离肾包膜，剪肾皮质于100目钢筛上研磨后，通过150目筛网，最后在200目筛网上收集肾小球，镜下观察纯度为99%，900 r/min离心10分钟，沉淀为肾小球，将其加入0.02% Ⅱ型胶原酶(Sigma公司，Hank液配)中37℃振荡孵育1小时，吹散细胞团，以含20% FCS的M199培养液混匀后离心10分钟，沉淀的细胞团吹散，置于无菌塑料培养瓶内，加入内皮细胞培养液［20%胎牛血清M199培养液，肝素5 U/ml，内皮细胞生长因子(Sigma公司)2 mg/ml，胰岛素，转铁蛋白及硒各5 μg/ml］，培养4小时后，洗去未贴壁细胞，贴壁的大部分细胞为内皮细胞，然后根据内皮细胞的生长形态，以机械划除法进行纯化^［3］。培养的内皮细胞用兔抗人Ⅷ因子抗体(中山公司)染色，选择染色结果为阳性的细胞株进行扩大培养。

二、原位杂交检测内皮细胞MCP-1表达

1.原位杂交探针的制作：杂交用探针为Gushing等^［4］报道的由35对碱基组成的寡核苷酸，它与MCP-1CDNA的第257-291个核苷酸互补，探针序列为3’-CGGATGTTGGGTTTGCTTGTCCAGGTGGTCCAAGG-5'(由上海细胞生物所合成)。采用寡核苷酸3’端地高辛标记和检测药盒(宝灵曼公司)，按照药盒说明书进行标记与检测。

2.原位杂交流程：第3代生长良好的内皮细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔细胞培养板，100 μl/孔，24小时后换无血清培养液，使细胞同步24小时，实验组含50 ng/ml TNFα(邦定公司)，正常对照组仅为无血清M1999培养液，然后分别孵育6h。弃去培养液，取出盖玻片，4% PFA室温固定20分钟，蛋白酶K于37℃消化20分钟，0.25%乙酸4℃ 30分钟，37℃预杂交45分，以浓度为2.5 μg/ml的MCP-1探针于42℃杂交16小时，以4×SSC、2×SSC洗片，20 μg/ml RNA酶消化，于以1×SSC，0.5×SSC洗片，3%BSA37℃封闭30分钟，1∶2000的地高辛抗体(宝灵曼公司)室温孵育1小时，NBT及BCIP暗盒内显色约5小时后终止，以不加探针的杂交液杂交的标本作为阴性对照。

三、免疫细胞化学检测内皮细胞MCP-1表达

细胞接种同上，实验组和正常对照组条件同前，分别孵育6小时后，弃去培养液，取出盖玻片，0.25%戊二醛室温固定15分钟，选用SP试剂盒(迈新公司)检测内皮细胞MCP-1表达，一抗为小鼠抗人MCP-1单抗(1∶500，Pharmigen公司)。以不加一抗，换为PBS的标本作为空白对照。

四、细胞ELISA法检测内皮细胞MCP-1表达

肾小球内皮细胞1×10⁶个/ml培养于25 cm²培养瓶中，24h后换无血清培养液，使细胞同步24h，然后消化细胞，按2×10⁵个/ml接种于96孔板(200 μl/孔)，待细胞完全融合后弃上清，含50 ng/ml TNFα无血清M199分别作用0、6、12、24h 4个时相点，含0、25、50、100 ng/ml 4个不同浓度TNFα的无血清M199分别作用6小时，于37℃，5%CO₂培养箱内培养，然后按Marui等^［5］方法进行测定，重复实验3次。

五、趋化试验

1.条件培养基的制备：肾小球内皮细胞1×10⁶/ml

培养于25 cm²培养瓶中，24小时后换无血清培养液，使细胞同步24小时，然后换含50 ng/ml TNFα无血清培养液培养6小时，收集上清即条件培养基，非条件培养基制备同上，只是加不含TNFα的无血清培养液。

2.人单核细胞白血病细胞株THP-1购于上海细胞生物所。用于趋化试验的单核细胞株浓度为1×10⁹/ml。

3.单核细胞迁移试验：用改良的Boyden小室进行^［6］，下室加满各种实验液，上室加入MC悬液，上下室间隔以硝酸纤维素微孔滤膜(Sigma公司，孔径8 μm，直径13 mm，厚度220 μm)，将小室置于37℃，5%CO₂培养箱中孵育90分，取出滤膜，甲醇固定，苏木精染色，脱水透明后，在40×10显微镜下，调微调旋钮至焦点对准滤膜表面作为起点，可见膜结构和大量MC，向下转动微调旋钮，可见细胞数目逐渐减少，至只有2～3个细胞为止，即为MC移动的终点。从微调平轮的刻度上读出起点到终点的微米数，即为MC移动的距离，每膜随机取5个视野，每组两级膜共10个视野，实验共进行3次，算出平均数和标准差。实验共分为4组，(1)随机移动组：上下室均为非条件培养基，以观察MC的随机移动，即为阴性对照组；(2)化学促动组：上下室均为条件培养基，以观察在上下室无趋化因子的浓度梯度时MC的移动，(3)趋化运动组：上室为非条件培养基，下室加入HUGEC条件培养基，以观察其对MC是否有趋化活性，(4)阳性对照组：上室为非条件培养基，下室加含10 ng/ml MCP-1(Promega公司)的无血清培养液。

4.抗MCP-1抗体对单核细胞迁移的影响：在HUGEC的条件培养基中加入抗MCP-1抗体，37℃温育2小时，然后离心5500 r/min，1分钟以除去免疫复合物。同时用MCP-1标准品代替条件培养基作阳性对照。共分6组：(1)非条件培养基组，(2)非条件培养基+Ab组，(3)条件培养基组，(4)条件培养基+Ab组，(5)阳性对照组，(6)阳性对照+Ab组。

六、统计方法

所有数据均以±s表