关键词： 细胞外基质；纤维蛋白溶解酶原激活物抑制物-1；纤维连接蛋白

【摘要】目的探讨白介素1β(IL-1β)对人肾小球系膜细胞表达纤维蛋白溶解酶原(纤溶酶原)激活物抑制物-1(PAI-1)和纤维连接蛋白(FN)的影响。方法应用Northern杂交检测体外培养的肾小球系膜细胞在IL-1β刺激后PAI-1和FN的mRNA表达，采用纤维蛋白平板法检测系膜细胞培养上清中PAI-1的活性，利用ELISA法检测FN的水平。结果IL-1β刺激组系膜细胞PAI-1和FN mRNA的表达显著增高(与对照组比，P＜0.05)，细胞培养上清中PAI-1的活性和FN的水平亦明显增加(与对照组比，P＜0.01)。结论IL-1β可以上调系膜细胞PAI-1和FN蛋白质及mRNA的表达，提示IL-1β可能通过抑制细胞外基质降解和增加细胞外基质合成而导致细胞外基质的积聚。

Effects of interleukin-1β on expression of plasminogen activator inhibitor-1 and fibronectin in cultured human mesangial cells

LIN Hongli,CHEN Xiangmei,CHENG Qingli,et al.Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Military Kidney Center,Beijing 100853

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of interleukin-1β(IL-1β)on expression of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) and fibronectin(FN) in cultured human mesangial cells.MethodsNorthern blot analysis was used to detect the expression of PAI-1 mRNA and FN mRNA in human glomerular mesangial cells cultured in media with or without IL-1β(5ng/ml).The activity of PAI-1 and the quantity of FN in culture supernatants were also determined by fibrin plate method and ELISA.ResultsIL-1β significantly increased the expression of PAI-1mRNA and FNmRNA in glomerular mesangial cells.The levels of PAI-1 and FN in the supernatants were markedly higher when the mesangial cells were cultured in the presence of IL-1β.ConclusionIL-1β can up-regulate the expression of PAI-1 and FN both in mRNA and protein level.IL-1β might contribute to glomerular sclerosis by inhibiting the degradation of extracellular matrix and promoting the synthesis of it.

【Key words】Extracellular matrixPlasminogen activator inhibitor-1Fibronectin

在肾小球疾病中，细胞外基质(ECM)积聚是导致肾小球硬化的重要因素。ECM的产生增加和(或)降解减少被认为是ECM积聚的主要原因^［1］。纤维连接蛋白(FN)是ECM的主要组成成分，在正常组织中表达较低，在组织损伤的炎症反应中表达增高。目前认为纤溶酶原/纤溶酶系统在ECM的降解中起主导作用，纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)是纤溶酶原激活物的主要生物抑制剂，在调节该系统活性中起关键作用^［2］。我们感兴趣的是在肾小球肾炎中上调的细胞因子IL-1β如何调节肾小球系膜细胞表达PAI-1和FN。IL-1β是作用较强的炎症因子，在包括肾小球肾炎在内的许多炎症性疾病中大量释放，肾小球系膜细胞也存在IL-1β受体^［3］，因此，我们选用IL-1β为刺激因子，以体外培养的系膜细胞为研究对象，检测PAI-1和FN mRNA及蛋白水平的变化，以期探讨上述变化在ECM积聚过程中的作用。

材料和方法

一、肾小球系膜细胞培养及鉴定

取因肾肿瘤行单侧肾切除病人的正常部分的肾皮质，将肾皮质剪碎并碾磨依次通过250 μm、106 μm、52 μm的筛网，收集肾小球，加入10%FCS RPMI 1640培养液于37℃，5% CO₂的孵箱中孵育。人系膜细胞鉴定：相差显微镜下观察其典型的形态学特征；免疫荧光显示结蛋白和肌动蛋白染色阳性，第Ⅷ因子相关抗原和细胞角蛋白均阴性。

二、实验分组

本实验采用第3代系膜细胞(置于25 cm²培养瓶，浓度为1×10⁵/ml)，细胞生长至融合状态时无血清同步24小时后进行实验分组，实验共采用12瓶细胞，其中实验组6瓶细胞，换用2%FCS RPMI 1640培养液，同时加入5 ng/ml的IL-1β刺激，分别于刺激后4小时及24小时收集细胞进行Northern杂交检测PAI-1和FNmRNA的表达、收集培养上清测定PAI-1活性及FN水平。另6瓶细胞不加IL-1β刺激换用2% FCS RPMI 1640培养液作为对照。

三、ELISA检测系膜细胞培养液上清FN的浓度

细胞培养上清中的FN的浓度用ELISA测定。以小鼠抗人FN单克隆抗体包被96孔培养板过夜后，PBS(pH 7.4)洗涤，1%BSA封闭，加入待测培养上清，37℃孵育3小时，PBS洗板，加兔抗人FN抗体，室温孵育60分钟，洗板后，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG孵育50分钟，洗板，以1，2-二氨基苯(OPD)显色，12.5 mmol/L硫酸终止反应。于酶联检测仪上读取492 nm的吸光度A值。

四、纤维蛋白板法测定PAI-1活性^［4］

用Tris缓冲液溶解纤维蛋白原，制成0.15%的纤维蛋白原溶液，铺板，加入凝血酶，水平放置使之完全凝固。将样品和尿激酶等体积混合，混匀后点样，37℃孵育过夜。

五、cDNA探针的制备及标记

1200 bp EcoRⅠ-BamHⅠ PAI-1 cDNA探针：从pUC19-PAI-1的质粒(由本室保存和克隆)中用酶切和geneclean的方法获得。1107 bp的人FN cDNA探针：由本室制备，以FN的PCR扩增的产物纯化获得。(引物序列：sense：5-’GATGTGGATG TCGATTTCAT-3’，antisense:5’-GATCTCTGGTCCATGAAGAT-3’)。随机引物法掺入α-³²P-dCTP标记PAI-1及FN探针。

六、Northern blot杂交

用TRI-zol试剂(GIBCOBRL公司)一步法提取系膜细胞的总RNA。取20 μg的RNA样品加入RNA变性缓冲液65～70℃变性10～15分钟，冰浴5分钟。1%的琼脂糖甲醛凝胶电泳，紫外固定，转入尼龙膜，转膜时间16～24小时。依次用PAI-1及FN探针进行杂交：65℃预杂交2小时，65℃杂交18～24小时，洗膜，放射自显影36小时。用GAPDH探针(由美国Vanderbit大学Ichikawwa教授惠赠)进行杂交作为内参照。凝胶图象分析仪扫描杂交带进行吸光度比较。

结果

一、IL-1β对肾小球系膜细胞FN蛋白质表达的影响

IL-1β(5 ng/ml)刺激组的系膜细胞培养上清中的FN含量与对照组相比在24小时时明显升高(A值0.38±0.021 vs 0.27±0.012，n=6，P＜0.05)，但IL-1β刺激4小时时无显著差别(A值0.26±0.011 vs 0.25±0.016，n=6，P＞0.05)。

二、IL-1β对肾小球系膜细胞PAI-1蛋白表达的影响

图1为纤维蛋白板法测定PAI-1活性的结果，对照组PAI-1活性较弱，IL-1β刺激组PAI-1活性明显增强。

图1IL-1β刺激后4小时及24小时系膜细胞培养液上清中PAI-1活性结果A，C：4小时及24小时对照组；B，D：4小时及24小时实验组

三、Northern杂交结果

如图2、图3及图4所示，IL-1β 5 ng/ml刺激4小时及24小时PAI-1mRNA表达均明显高于对照组(P＜0.01)；FN mRNA表达亦明显高于对照组(4小时P＜0.01，24小时P＜0.05)。

图2Northern杂交分析系膜细胞FNmRNA及PAI-1mRNA的表达：20 μg的总RNA电泳后用FN及PAI-1cDNA探针杂交，GAPDH作为内参照。1，3：系膜细胞4及24小时对照组；2，4：系膜细胞4及24小时IL-1β刺激组

图3IL-1β刺激系膜细胞FNmRNA表达的定量分析

图4IL-1β刺激系膜细胞PAI-1mRNA表达的定量分析

讨论

ECM是细胞的支架组织，在细胞的粘附、迁移、增殖和分化过程中有着重要的作用，ECM合成和降解失衡是导致肾小球硬化的重要的病理生理因素。FN是肾小球ECM的主要成分，在正常肾脏的基础表达较低，但在组织的炎性损伤中表达增高。FN具有明显的结合纤维蛋白、纤维蛋白原及胶原的能力，因此FN可能作为这些ECM成分间的中心环节而起作用。目前有关FN和肾脏疾病关系的研究较多，但尚未见有关IL-1β对肾小球系膜细胞FNmRNA表达影响的报告。我们的研究结果表明，IL-1β可以上调系膜细胞FNmRNA及蛋白质的表达。提示在肾小球炎性疾病中，IL-1β增高引起FN的合成增加很可能是ECM生成过多的重要因素。

除ECM生成过多外，其降解